分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解

一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg.1min，弃上清。取三次；3、加BufferS1200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加BufferW1500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加BufferW2700ul，12000xg，1min，弃滤液。重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）三、酶切体系EcoRⅠ1ul如需要6管，则先统一配7管的量，再分别加入酶的总量不宜超过总体系的10%，以防星活性的发生BamHⅠ1ulBufferEcoRⅠ5ul以此定体系，稀释成1X的就好BSA0.5ul使其终浓度为100ug/ul（1X）去离子水30.5ul定容至BufferEcoRⅠ1X的量Plasmid12ul量要足够Sum50ul37°两小时以上即可四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，LoadingBuffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入goldview0.5ul/25ml；倒入槽里。2、跑胶：单位厘米/5-10v。所以大槽25cm，150v即可。小槽100v即可。3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：pLXSNAmp+135pLXSNAmp+S100PNOGDKK对照Insert7ul3ul7ul0ulVector—pLXSN1ul1ul1ul1ulT4连接酶1ul1ul1ul1ulBuffer1ul1ul1ul1ul去离子水0ul4ul0ul7ulpLRES2Kana+246pLRES2Kana+S100PNOGDKK对照Insert7ul3ul7ul0ulVector—pLRES21ul1ul1ul1ulT4连接酶1ul1ul1ul1ulBuffer1ul1ul1ul1ul去离子水0ul4ul0ul7ul16℃过夜六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ulLB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1mlLB体系：1mlLB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ulPcr体系：7.5ulMix（2X）5.5ulwater1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1mlLB体系中，再吹打于15ulPcr体系中；（4）1mlLB体系放入37℃摇床，150rpm；（5）15ulPcr调节：360酶Promega酶步骤温度℃时间步骤温度时间1940:02:001950:02:002940:00:302950:00:30360（可调节）0:00:303600:00:304720:00:454720:00:455GOTO2REP345GOTO2REP346720:10:006720:10:007HOLD4.0°ENTER7HOLD4