第四部分 目的基因的获得5

第四部分目的基因的获得五.酵母双杂交系统分离目的基因

酵母双杂交系统

(YeastTwo-hybridSystem)用途：快速筛选与一种已知蛋白结合的目的蛋白，发现新基因验证已知蛋白间的相互作用及作用强度转录因子的组件结构特性

（a)酵母转录因子GCN4的结构域；（b）哺乳动物糖皮质激素受体蛋白质的结构域。负责特定基因对糖皮质激素反应的转录因子细胞因子Oct1－1对基因转录的激活作用

通过宇具有激活域的单纯疱疹病毒VP16的作用激活基因转录His,β-gal双杂交系统工作原理示意图双杂交系统的载体双报告基因系统常用的“猎物”蛋白普通双杂交系统的组成示意图蛋白质三杂交系统通过小分子的三杂交系统RNA介导的三杂交系统负选择系统双诱饵系统SOS恢复系统NormalTranscription.NormaltranscriptionrequiresboththeDNA-bindingdomain(BD)andtheactivationdomain(AD)ofatranscriptionalactivator(TA).YeastTwoHybridSystemYeasttwo-hybridtranscription.Theyeasttwo-hybridtechniquemeasuresprotein-proteininteractionsbymeasuringtranscriptionofareportergene.IfproteinXandproteinYinteract,thentheirDNA-bindingdomainandactivationdomainwillcombinetoformafunctionaltranscriptionalactivator(TA).TheTAwillthenproceedtotranscribethereportergenethatispairedwithitspromoter.Theyeasttwo-hybridassayusestwoplasmidconstructs:thebaitplasmid,whichistheproteinofinterestfusedtoaGAL4bindingdomain,andthehunterplasmid,whichisthepotentialbindingpartnerfusedtoaGAL4activationdomain.

酵母双杂交系统操作的基本流程大规模双杂交筛选的方法双杂交系统原理图酵母双杂交系统(YeastTwo-hybridSystem)优点：根据兴趣蛋白的基因序列即可筛选与其作用的目的蛋白蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被检测出来可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。酵母双杂交系统(YeastTwo-hybridSystem)局限性：表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与天然状态不符，造成结果的不准确本身就具有转录激活活性的兴趣蛋白不适合于该系统不能定位于核内的兴趣蛋白不适合于该系统需要翻译后修饰的蛋白不适合该系统第四部分目的基因的获得六.DNA插入作用分离目的基因 ——基因标签法（gene-tagging)反向遗传学方法（reversegenetictechnique) 1.T-DNA标签法 2.转座子标签法（transposontagging)

T-DNAandanyDNAcontainedwithinitareinsertedintoaplantchromosomeinthetransgenicplantandthentransmittedinaMendelianpatternofinheritance.

AnexampleofcloningbasedonT-DNAtaggingisdescribedinthearticlebyMeyeretal.(1996).T-DNA

标签过程示意基因的分离1.构建突变体的基因组库以T－DNA标签序列为探针杂交筛选基因文库。2.以T－DNA标签序列设计PCR引物，IPCR。3.如果在T－DNA标签构建时插入大肠杆菌的复制子（eg.PBR322部分序列），提取突变体核DNA，酶切后连接酶使之环化，转化细菌，筛选出带标签的克隆。得到了与T－DNA标签相连的的植物DNA片断后，筛选野生型基因组文库，得到相关的完整基因。功能恢复予以确证。第四部分目的基因的获得六.DNA插入作用分离目的基因 2.转座子标签法（transposontagging) (1) 转座子transposon

第四部分目的基因的获得六.DNA插入作用分离目的基因 2.转座子标签法（transposontagging) (1) 转座子transposon 转座酶transposase Ac/DsSpm(En)/dSpm(I)Tam Ac(Activator) Ds(Dissociation)(2)转座子系统克隆基因Ac/Ds双系统法sAc(stable-Ac)

Transpositionisthemovementofspecificgeneticelementsfromonelocustoanother,andrequiresthreemacromolecularelements:thetransposon(elementbeingtransferred),thetransposase(enzymecatalyzingtransfer),andthetargetDNA(elementitistransferredto)TransposonsStructureofTn34957bpampcillin-resistanceblatransposasetnpA“repressor”tnpRTn3resolvase3trans-actinggenes:2cis-actingsites:38bpinvertedrepeatends120bp“IRS”orresinternalresolutionsiteTn10Tn5isaCompositeTransposonInsertionsequencesAntibioticresistancegenes第三章目的基因