第四章 目的基因的制备1

主讲教师:任国领生命科学学院第四章

目的基因的制备为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中分离其编码蛋白（酶）的结构基因，创造出有价值的新物种。生物界的长期进化积累了大量对人类有用的基因，这是一个宝贵的资源。准备要分离、改造、扩增、表达的基因。一、目的基因转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或TAA或TGA)、终止转录区1、结构基因的组成一、目的基因基因区：操纵子;基因之间有间隔序列。启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：5’AGGAGGU3’，核糖体16SrRNA识别、结合mRNA的位置。（1）原核生物基因的组成一、目的基因转录终止子和终止因子分别指基因或操纵子3’端提供转录终止信号的DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹。一、目的基因基因区：ATG+extrons+introns+TAA（TGA或TAG）转录启动区：r、m、tRNA分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。编码蛋白的启动子(RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区：

-20~-30的TATAA/TA区(Hogness框)——起始解链，决定起录点。

-75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)与RNA聚合酶结合有关

-75区上游有一共有序列GGGCGC(GC框)——结合某些转录因子转录终止区:（2）真核生物基因的组成一、目的基因2、基因的排列一般：直线排列于DNA上，且两基因之间有非编码序列。特例：（1）重叠基因（2）重复基因（3）加倍基因（4）基因重排约30%真核基因是多拷贝较高等的生物基因组是二倍体或多倍体质粒在宿主内是多拷贝基因组中同一基因簇处于不同细胞而发生基因排列变化一、目的基因二、目的基因的制备1.直接分离法2.构建基因组文库分离法3.PCR分离法4.化学合成法二、目的基因的制备1.直接分离法（1）限制性核酸内切酶酶切分离法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片段。二、目的基因的制备应用对象适用于从简单的基因组中分离目的基因，如质粒或病毒大小只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码基因比较少，获得也比较简单。已定位：根据目的基因两侧的已知的酶切位点，一次就可以获得。已定序：只需要用已知序列的限制性内切酶进行一次或者多次酶切，分离纯化所需的DNA片段，与适当载体连接。未定序或无定位：也只需酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，然后钓出目的基因。二、目的基因的制备优点由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。缺点目的基因易被切碎。二、目的基因的制备（2）随机片段法①限制性内切酶局部消化法控制酶的用量和时间，使基因组的酶切位点只有一部分被随机切开。选用原则：a.内切酶识别位点和碱基数b.内切酶粘性末端二、目的基因的制备②机械切割法a.超声波b.高速搅拌1500转/分搅拌30min，产生约8kb的随机片段。二、目的基因的制备（3）物理化学法基本原理：AT和GC之间氢键的差异，导致不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质如浮力密度和解链温度等也明显不同，采用相应的方法即到达分离的目的。二、目的基因的制备1.直接分离法2.构建基因组文库分离法3.PCR分离法4.化学合成法二、目的基因的制备2、构建基因组文库分离法用克隆载体将某种生物的基因组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体，即构成了这种生物的基因组文库。若只储存某生物基因组的部分遗传信息，即构成部分基因组文库。（1）基因组文库的定义将某种生物的基因组DNA切割成大小合适的片段，并将这些所有片段与适当的载体连接起来，转入相应的受体细胞中进行保存和扩增。理论上将，这些重组载体带有该生物的全部基因。称基因文库（GeneLibrary）二、目的基因的制备N=ln(1-P)/ln(1-f)N：文库必需的克隆数P：文库中目的DNA片段的出现概率f：插入片段大小/全基因组大小的比值（2）基因组文库的大小二、目的基因的制备（3）基因组文库的构建对载体的要求载体能容载的DNA片段大小直接影响到构建完整的基因组文库所需的重组子的数目。载体的容量越大，需要的重组子越少。目前常用的载体二、目的基因的制备载体与片段的连接方式直接连接、人工接头或同聚物加尾。①粘性末端直接连接②人工接头法人工合成的限制性内切酶粘性末端片段。二、目的基因的制备③同聚物加尾二、目的基因的制备获得含基因的DNA片段与λ噬菌体克隆载体重组转化受体菌并筛选重组子（见导入受体细胞第五章）①构建λ噬菌体基因组文库的步骤常见的基因组文库的构建二、目的基因的制备目的基因准备要分离、改造、扩增、表达的基因。1.什么叫目的基因？由哪些部件组成？原核和真核生物结构基因的组成有何区别？转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或TAA或TGA)、终止转录区知识回顾基因区：操纵子;基因之间有间隔序列。启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：5’AGGAGGU3’，核糖体16SrRNA识别、结合mRNA的位置。（1）原核生物基因的组成转录终止子和终止因子基因或操纵子3’端提供转录终止信号的DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹。知识回顾基因区：ATG+extrons+introns+TAA（TGA或TAG）转录启动区：编码蛋白的启动子(RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区

-20~-30的TATAA/TA区(Hogness框)——起始解链，决定起录点。

-75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)与RNA聚合酶结合有关

-75区上游有一共有序列GGGCGC(GC框)——结合某些转录因子转录终止区:

mRNA3'PolyA位点“AAUAAA”为链的切断和多聚腺苷化提供信号。（2）真核生物基因的组成知识回顾2.基因排列有哪些特例？特例：（1）重叠基因（2）重复基因（3）加倍基因（4）基因重排约30%真核基因是多拷贝较高等的生物基因组是二倍体或多倍体质粒在宿主内是多拷贝基因组中同一基因簇处于不同细胞而发生基因排列变化不同基因共用一段DNA序列。知识回顾基因组文库的构建过程:酶解制备外源DNA;酶切载体;连接重组并包装进噬菌体;重组体转染宿主菌。

优:比λ噬菌体容纳的外源DNA大(30～45kb),构建完整文库所需克隆数少;载体仅约5kb,可直接分析插入片段的限制性图谱,而λ噬菌体则否。缺点

:难筛选;重组效率低(105～6～104～5clongs/μgDNA);不易储存。

3、图示说明考斯质粒基因组文库的构建，指出与λ噬菌体载体的区别。有何优缺点？知识回顾1)外源DNA片段的分离和制备上稍微差异；2）载体的处理比较简单。3重组时，质粒DNA的量要比插入片段的量高10倍，以便插入片段最大量的连接。4）需要预培养一段时间再转染，得到的不是噬菌斑而是菌落。知识回顾2、cDNA基因文库的构建及目的基因的分离（1）cDNA文库的概念cDNA以mRNA为模板逆转录酶的作用下逆转录出的DNA。cDNA基因(部分)文库某生物基因组转录的全部或部分mRNA经反转录产生的各种cDNA片段，分别与载体重组而存在于一种受体的群体。二、目的基因的制备1.直接分离法2.构建基因组文库分离法3.PCR分离法4.化学合成法二、目的基因的制备3、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因3.1直接从基因组中扩增适合原核生物。？二、目的基因的制备3.2从mRNA中扩增：RT－PCR适合真核生物。？3.3其他类型的PCR（见第二章）二、目的基因的制备1.直接分离法2.构建基因组文库分离法3.PCR分离法4.化学合成法二、目的基因的制备4、基因的化学合成150～200bp以内可化学合成.要获得较大的高等真核基因必须设计一种特殊方法,能把合成的DNA片段构建成完整的基因的过程.称为基因组装.1979年首次化学合成有活性的大肠杆菌酪氨酸转移核糖核酸基因.现用DNA合成仪快速合成寡核苷酸片段,再用酶化学法获得目的基因DNA片段.（1）基因化学合成的概况（2）基因的组装方式二、目的基因的制备20世纪70年代提出,常用的有两种:全片段酶促连接法:

酶促填充法:（3）化学合成方法的相关知识见第二章二、目的基因的制备（1）cDNA文库的特点4、cDNA基因文库有何优点？如何构建？知识回顾分离细胞总RNA,纯化分离mRNA。以mRNA为模板，合成cDNA第一链双链cDNA的合成将合成的双链DNA重组入载体，导入宿主(大肠杆菌)增殖（2）cDNA文库的构建知识回顾2、cDNA基因文库的构建及目的基因的分离分离细胞总RNA以mRNA为模板，合成cDNA第一链双链cDNA的合成常用方法:第一第二第三第四、五将合成的双链DNA重组入载体，导入宿主(大肠杆菌)增殖（2）cDNA文库的构建目的基因筛选的策略

•1、核酸杂交筛选•2、抗体筛选•3、功能结合法筛选1、核酸杂交筛选（1）原理

将基因文库的菌落或噬菌斑原位转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜之后，进行裂解，释放DNA并且固定在膜上，利用特异的核酸探针进行筛选，根据碱基配对原则筛选到目的基因。（2）如何获得核苷酸探针？1）“基因园”：同源基因筛选

2）寡核苷酸简并引物探针：对目的基因的表达产物的氨基酸序列有所了解，则可以从这些氨基酸序列倒过来推导出核酸的可能序列，合成寡核苷酸作为探针。2、抗体筛选

（1）适用范围：已有目的基因表达产物的特异性抗体，利用抗体筛选表达特异抗原的克隆。

（2）原理：将cDNA定向克隆到表达载体构建成表达文库，用能与目的基因表达产物特异结合的抗体与文库中能表达目的基因的克隆结合，再用标记的二抗与一抗结合，指示目的基因所在克隆。3、功能结合法筛选

适用范围：已知目的基因表达产物的功能（1）噬菌体显示法（phagedisplay）（2）酵母单、双杂交法1985年，美国Missouri大学的SmithGP首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程手段改造，他把EcoRⅠ内切酶的部分基因片段与丝状噬菌体的次要衣壳蛋白pⅢ(proteinⅢ)基因融合，获得的重组噬菌体能被抗EcoRⅠ内切酶的抗体所识别，由此建立了噬菌体展示技术(phagedisplaytechnology)。噬菌体展示技术能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，为筛选到目的蛋白或多肽奠定了基础。（1）噬菌体显示法（phagedisplay）噬菌体展示技术的原理

噬菌体展示技术是将外源DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。然后利用靶分子，采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来。酵母双杂合系统真核生物的位点特异转录激活因子：BDAD图（2）酵母单、双杂交法PGBT9又叫DNA-BD质粒载体，其GAL4结构域编码序列GAL4BD克隆在乙醇脱氢酶基因启动子PADH1下游，在GAL4BD和乙醇脱氢酶基因转录终止子TADH1之间存在多克隆位点（MCS），允许诱饵蛋白编码序列的插入。诱饵蛋白基因是按照正确的取向和读码结构被克隆在这个载体的多克隆位点上，于是就在诱饵蛋白和GAL4-BD之间产生融合作用，形成杂种蛋白I;酵母质粒有PGBT9和PGAD424。PGAD424又叫AD质粒载体，用来构件欲筛选靶蛋白的cDNA文库的专用载体，其GAL4激活域序列GAL4AD克隆在乙醇脱氢酶基因启动子PADH1下游，在GAL4AD和乙醇脱氢酶基因转录终止子TADH1之间存在多克隆位点，允许靶蛋白cDNA的插入。克隆的cDNA片段按照正确的取向和读码结构插入在载体的多克隆位点区内，因此cDNA编码的蛋白质便会同GAL4-AD之间产生融合作用，形成杂种蛋白Ⅱ。。这两种杂种蛋白质都能在酵母细胞中得到高水平的表达。而且在核定位序列的作用下进入到酵母的细胞核内。（一）筛选目的基因的差别杂交及减法杂交技术1、差别杂交定义：分别制备两种细胞群体的mRNA提取物，其中一个群体含有目的基因mRNA，另一个群体不含。以这两种总mRNA（或其cDNA)为探针，分别筛选由表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库。原理图缺点：灵敏度低，不适于分离低丰度mRNA的目的基因；需筛选大量杂交滤膜，鉴定大量噬菌斑，十分费时耗力；差别杂交重复性差。三、目的基因的分离2、减法杂交技术定义：通过DNA复性动力学富集目的基因序列，并构建减数文库来克隆目的基因。其本质是尽量消除两种样品共同存在的基因序列，从而有效富集目的基因序列。（1）mRNA减法杂交从表达目的基因的组织提取mRNA并反转录为cDNA，再与无目的基因表达的组织提取的mRNA做过量杂交，两者均表达的基因产物将形成cDNA/mRNA杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA仍单链，将其分离即为差异表达序列。（二）利用差示分析法分离目的基因克隆1、mRNA差别显示技术（差别显示反转录PCR）