第六章 抗体制备技术

第六章

抗体制备技术抗体的一些基本概念多克隆抗体（PolyclonalAntibody）：

即多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体单克隆抗体（MonoclonalAntibody）：

即由单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体

EpitopesonthesurfaceofpathogensViralsurfaceproteinepitopesWholeVirusparticlesurfaceofproteins多克隆抗体的特点

制备方便，操作简单，可大量产生容易发生沉淀反应，出现沉淀线异质性：抗体种类多样，化学组成复杂，含有较多的无关Ig存在针对多种抗原或一种抗原不同表位的一系列亲和力不同的抗体

重复性差，批间差异很大

免疫原需要纯化

易出现交叉反应单克隆抗体的特点

高度均质（同一亚类），化学组成均一，不含

或很少含无关Ig特异性强，只针对一种抗原表位

亲和力强

抗原用量少，无需纯化

无批间差异

来源稳定，可大批生产，容易标准化

不易形成沉淀线

操作比较麻烦多克隆抗体与单克隆抗体区别什么情况需要制备单抗目的蛋白有结构类似物抗原不纯，无法分开多抗效果不好（已排除非特异性反应）希望将抗体用于治疗，研制成药品希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂

单克隆和多克隆抗体的比较和用途特异性敏感性均一性McAbPcAb低差无高强有1.用于免疫学检测，辅助临床诊断2.McAb用于亲和层析，分离微量可溶性抗原3.标记的McAb用于基础研究，了解细胞分化等4.制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗抗体名称抗体种类 靶向抗原

适应症

批准日期

OKT3

鼠单抗 CD3

移植排斥1986

Panorex

鼠单抗 17-1A

大肠癌

1995

ReoPro

人-鼠嵌合Fab血小板受体

冠心病

1994

ⅡbⅢa

Rituxan人-鼠嵌合抗体CD20

淋巴瘤

1997

Simulect

人-鼠嵌合抗体CD25

移植排斥

1998

Remicade

人-鼠嵌合抗体TNF-α

炎症性肠病、

1998

类风湿关节炎

1999Zanapax

人源化抗体 CD25

移植排斥

1997

Herceptin

人源化抗体HER-2

乳腺癌

1998

Synagis

人源化抗体RSVF蛋白

RSV感染

1998

Mylotarg

人源化抗体-CD33

淋巴瘤

2000

化疗药物交联物Campath

人源化抗体 CD52

淋巴瘤

2001

已批准上市的治疗性单抗购买抗体时要注意厂商的标注适合于做什么实验，使用浓度多少？WB（Westernblotting，免疫印迹）IH（Immunohistochemistry,免疫组织化学）IC（Immunocytochemistry,免疫细胞化学）IEM（Immunelectronmicroscopy，免疫电镜）FCM（FlowCytometry，流式细胞仪）ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassey,

联免疫吸附实验，联免疫分析）第一节 多克隆抗体制备技术第二节 单克隆抗体制备技术第三节 基因工程抗体制备技术第四节 抗体库技术

第六章 抗体制备技术

第一节 多克隆抗体制备技术第二节 单克隆抗体制备技术第三节 基因工程抗体制备技术第四节 抗体库技术

第六章 抗体制备技术

第一节

多克隆抗体制备技术

一、多克隆抗体制备的原理二、多克隆抗体制备的基本条件三、多克隆抗体制备的基本方法第一节

多克隆抗体制备技术

一、多克隆抗体制备的原理二、多克隆抗体制备的基本条件三、多克隆抗体制备的基本方法一、

多克隆抗体制备的原理

多克隆抗体制备的基本流程第一节

多克隆抗体制备技术

一、多克隆抗体制备的原理二、多克隆抗体制备的基本条件三、多克隆抗体制备的基本方法二、

多克隆抗体制备

的基本条件

1.免疫原的制备2.免疫动物的选择3.佐剂的准备二、

多克隆抗体制备

的基本条件

1.免疫原的制备2.免疫动物的选择3.佐剂的准备1.免疫原的制备

（1）完全抗原的提取（2）半抗原与载体的交联（3）合成肽抗原（1）完全抗原的提取细胞破碎法抗原的提取抗原的纯化冷热交替法反复冻融法超声破碎法玻璃匀浆法自溶法酶处理法水溶液提取法有机溶剂提取法超滤盐析电泳凝胶过滤离子交换亲和层析･･････温度骤变迅速解冻超声剪切物理研磨自身裂解蛋白酶切载体的选择半抗原与载体的偶联方法偶联复合物的鉴定天然蛋白质合成类载体吸收光谱法放射性标记法（2）半抗原与载体的交联化学偶联法半抗原的制备半抗原与载体偶联策略免疫原性肽的选择肽的合成与纯化计算机模拟试验凝胶过滤法反向高效液相色谱（3）合成肽抗原

细胞、细菌和病毒等，一般具有较强的免疫原性，可不加佐剂。例如，直接腹腔注射1~2×107个细胞。颗粒性抗原：

可溶性抗原的来源主要是天然纯化，或者用目的基因在原核或真核细胞内表达。可溶性抗原需与弗氏完全或不完全佐剂混匀，进行免疫。可溶性抗原：免疫原制备二、

多克隆抗体制备

的基本条件

1.免疫原的制备2.免疫动物的选择3.佐剂的准备2.免疫动物的选择

兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，

抗体量较多（新西兰、大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但

抗体量很少（BALB/C、昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过

程要麻醉动物（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于较大批量地

生产抗体（商品）马（horse）：常用于大批量生产治疗用

抗体（商品）。豚鼠（guineapig）：国外实验室常用二、

多克隆抗体制备

的基本条件

1.免疫原的制备2.免疫动物的选择3.佐剂的准备佐剂的生物学功能

缓释

促吞噬

激活免疫应答

增强辅助性T细胞

促进淋巴细胞分化和抗体分泌

提高初次和再次免疫应答的抗体滴度

改变抗体类型、促进迟发性超敏反应佐剂的种类

无机佐剂：

氢氧化铝、明矾等

有机佐剂：

分枝杆菌、百日咳杆菌、内毒素等

合成佐剂：

双链多聚核苷酸、左旋咪唑、异丙肌苷

油剂：

弗氏佐剂、花生油、矿物油、植物油等第一节

多克隆抗体制备技术

一、多克隆抗体制备的原理二、多克隆抗体制备的基本条件三、多克隆抗体制备的基本方法三、

多克隆抗体制备

的基本方法

1.抗原剂量、免疫途径与免疫日程2.小样试血与采血3.抗体的分离和纯化技术4.抗体的鉴定5.抗体的保存三、

多克隆抗体制备

的基本方法

1.抗原剂量、免疫途径与免疫日程2.小样试血与采血抗体的分离和纯化技术抗体的鉴定抗体的保存抗原的剂量蛋白质抗原耐受剂量小鼠：为20～400μg/0.2ml/次大鼠：100～1000μg/0.5ml/次兔：200～2000μg/2ml/次羊：5～20mg/5ml/次免疫动物的方法

免疫原制备无佐剂免疫法——适用于颗粒性抗原福氏佐剂免疫法——适用于可溶性抗原铝佐剂免疫法——适用于人免疫免疫动物皮内免疫法皮下或肌肉免疫法淋巴结免疫法混合法

抗体效价满意后静脉注射加强免疫抗原免疫的基本策略加强免疫的剂量：约首次剂量的1/2加强免疫的时间：间隔2～8周加强免疫次数：2-5次高特异性的抗血清：低剂量短间隔免疫法高效价的抗血清：高剂量长程免疫法常见注射方法肌肉注射法尾静脉注射三、

多克隆抗体制备

的基本方法

1.抗原剂量、免疫途径与免疫日程2.小样试血与采血抗体的分离和纯化技术抗体的鉴定抗体的保存抗血清的获得

眼眶取血颈动脉放血心脏采血免疫效果评价取血：兔耳静脉、鼠尾静脉检测：双向免疫扩散（1:32以上）ELISA（1：5000以上）三、

多克隆抗体制备

的基本方法

1.抗原剂量、免疫途径与免疫日程2.小样试血与采血3.抗体的分离和纯化技术4.抗体的鉴定5.抗体的保存抗体的分离和纯化技术

盐析法

凝胶过滤法

离子交换层析法

亲和层析法

电泳分离法三、

多克隆抗体制备

的基本方法

1.抗原剂量、免疫途径与免疫日程2.小样试血与采血3.抗体的分离和纯化技术4.抗体的鉴定5.抗体的保存4.抗体的鉴定蛋白浓度测定：

紫外分光比色法，双缩脲法、

福林-酚法、

二辛可宁酸（BCA）法，

考马氏蓝法，Lowry法等免疫效果评价：

双向免疫扩散、ELISA纯度分析：免疫印迹抗体类别分析：免疫金试条亲和力分析：ELISA、Biacore、荧光偏振三、

多克隆抗体制备

的基本方法

1.抗原剂量、免疫途径与免疫日程2.小样试血与采血3.抗体的分离和纯化技术4.抗体的鉴定5.抗体的保存5.抗体的保存抗体的浓缩：

吸收、蒸发、超滤抗体的保存：

浓缩抗体+防腐剂+甘油免疫效果不佳可能的原因第一节 多克隆抗体制备技术第二节 单克隆抗体制备技术第三节 基因工程抗体制备技术第四节 抗体库技术

第六章 抗体制备技术

第二节单克隆抗体制备技术

一、单克隆抗体制备的原理二、单克隆抗体制备的基本条件三、单克隆抗体制备的基本方法第二节单克隆抗体制备技术

一、单克隆抗体制备的原理二、单克隆抗体制备的基本条件三、单克隆抗体制备的基本方法单克隆抗体制备技术细胞工程抗体技术、B细胞杂交瘤技术

问题的由来：

B细胞抗体单克隆B细胞单克隆抗体如何获得抗原特异性的B细胞克隆？如何使B细胞长期存活，永远产生抗体？

而：肿瘤细胞永生性细胞功能的嵌合BCELLCANCERCELL？抗体分泌永生性可能性：Barski等（1960）发现细胞的自然融合现象，但频率很低。冈田等（1967）和Kao等（1974）分别发现灭活的仙台病毒（HVJ）和聚乙二醇（PEG）能显著提高细胞融合率。Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodiesofpredefinedspecificity.Nature1975,256:495绵羊红细胞小鼠脾细胞导致生命科学领域的一场革命！骨髓瘤细胞仙台病毒GeorgesJ.F.KöhlerCésarMilsteinHybridomas:Themakingofarevolution.Science1982Vol205pp1073-1075NielsK.JerneGeorgesJ.F.KoehlerFederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunology

Basel,Switzerland(1946-1995)CarMilstein(1927-2002)ArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiology

Cambridge,UnitedKingdom第二节单克隆抗体制备技术

一、单克隆抗体制备的原理二、单克隆抗体制备的基本条件三、单克隆抗体制备的基本方法单克隆抗体的制备过程

二、单克隆抗体制备

的基本条件

1.动物的免疫酶缺陷型骨髓瘤细胞的筛选

和培养3.单抗检测方法的建立二、单克隆抗体制备

的基本条件

1.动物的免疫酶缺陷型骨髓瘤细胞的筛选

和培养3.单抗检测方法的建立1.动物的免疫抗原与载体动物的选择免疫途径第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐剂第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐剂第三次免疫：可溶性抗原加生理盐水小鼠背部皮下注射小鼠背部皮下注射4周后3周后小鼠腹腔注射10天后检测血清效价加强免疫：可溶性抗原加生理盐水小鼠腹腔注射细胞融合3天后免疫动物举例二、单克隆抗体制备

的基本条件

1.动物的免疫酶缺陷型骨髓瘤细胞的筛选

和培养3.单抗检测方法的建立骨髓瘤细胞的演化酶缺陷型骨髓瘤细胞的筛选HGPRT缺陷型骨髓瘤细胞的选择：

8-杂氮鸟嘌呤（8-azaguanine，8-AG）

6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine，6-TG)TK缺陷型骨髓瘤细胞的选择：溴脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，

BrdU）细胞DNA生物合成途径嘌呤合成旁路途径核酸生物合成主要途径嘧啶合成旁路途径次黄嘌呤（H）氨基酸谷氨酰胺尿核苷单磷酸DNA胸腺嘧啶脱氧核苷酸鸟嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）TK（胸腺嘧啶核苷激酶）酶缺陷型细胞的筛选嘌呤合成旁路途径核酸生物合成主要途径嘧啶合成旁路途径次黄嘌呤（H）氨基酸谷氨酰胺尿核苷单磷酸DNA胸腺嘧啶脱氧核苷酸鸟嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）TK（胸腺嘧啶核苷激酶）8-AG或6-TGBrdU二、单克隆抗体制备

的基本条件

1.动物的免疫酶缺陷型骨髓瘤细胞的筛选

和培养3.单抗检测方法的建立单克隆抗体的鉴定免疫酶技术免疫荧光技术免疫扩散试验第二节单克隆抗体制备技术

一、单克隆抗体制备的原理二、单克隆抗体制备的基本条件三、单克隆抗体制备的基本方法三、单克隆抗体制备

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产三、单克隆抗体制备

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产组织培养的基本条件仪器：包括CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、液氮罐、低速低温离心机等试剂：培养液、HAT培养液、HT培养液、

牛血清、抗生素等耗材：培养板、培养瓶、吸管、移液管等组织培养的常用仪器骨髓瘤细胞系的选择要点所选择的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物品系相同自身不产生免疫球蛋白的重链与轻链对氨基碟呤敏感与免疫脾细胞融合后产生稳定分泌Ig杂交瘤细胞三、单克隆抗体制备

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产饲养细胞的作用：小鼠腹腔巨噬细胞小鼠脾细胞成纤维细胞饲养细胞（feedercell）

增加细胞密度，满足新生的杂交瘤细胞对

细胞密度的要求吞噬清除死亡的细胞分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞的生长饲养细胞的种类和制备方法：三、单克隆抗体制备

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产拉颈处死小鼠无菌操作取出脾脏清洗、研磨收集细胞离心洗涤细胞计数脾细胞的分离三、单克隆抗体制备

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产细胞融合的方法

PEG融合

仙台病毒

电融合细胞融合骨髓瘤细胞与脾细胞

按1:10或1:5的比例混合并加入促融剂PEGPEGPEG介导的细胞融合融合后的细胞类型脾细胞脾细胞×脾细胞脾细胞×瘤细胞瘤细胞×瘤细胞瘤细胞BCELLCANCERCELL三、单克隆抗体制备

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾B细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产杂交瘤细胞的选择性培养HAT选择性培养的原理：细胞的DNA生物合成有主要途径和补偿途径。当有氨基碟呤存在时，能够阻断DNA合成的主要途径，需通过补偿途径合成DNA，这时就需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用次黄嘌呤合成DNA，或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷合成DNA。正常细胞DNA生物合成途径嘌呤合成旁路途径核酸生物合成主要途径嘧啶合成旁路途径次黄嘌呤（H）氨基酸谷氨酰胺尿核苷单磷酸DNA胸腺嘧啶脱氧核苷酸鸟嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）TK（胸腺嘧啶核苷激酶）氨基蝶呤（A）酶缺陷型细胞的筛选嘌呤合成旁路途径核酸生物合成主要途径嘧啶合成旁路途径次黄嘌呤（H）氨基酸谷氨酰胺尿核苷单磷酸DNA胸腺嘧啶脱氧核苷酸鸟嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）TK（胸腺嘧啶核苷激酶）8-AG或6-TGBrdU氨基蝶呤（A）HAT选择性培养H：次黄嘌呤A：氨基喋呤T：胸腺嘧啶核苷

融合后3~4天后，可见外形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮的克隆。融合后第7~9天取培养上清，检测特异性抗体。细胞生长情况：

筛选后存活的细胞脾细胞脾细胞×脾细胞脾细胞×瘤细胞瘤细胞×瘤细胞瘤细胞获得杂交瘤细胞三、单克隆抗体制备

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产分泌单克隆抗体杂交瘤细胞的检测方法免疫酶技术间接ELISA免疫荧光技术间接免疫荧光测定法

流式细胞术分析（阴性对照：骨髓瘤细胞培养上清；

阳性对照：免疫鼠血清）三、单克隆抗体制备

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产阳性细胞的单克隆化克隆（cloning）：由单个细胞繁殖、扩增而形成性状均一的细胞集落的过程。

有限稀释法软琼脂克隆技术有限稀释法从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞，经逐步稀释，使每孔只有一个细胞。软琼脂克隆技术从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞，以适当浓度杂交瘤细胞加入软琼脂培养基中，形成由一个细胞增殖而成的细胞集落。。杂交瘤细胞的克隆化筛选：单克隆抗体的鉴定抗体敏感性的测定

——对腹水和培养上清进行效价测定抗体特异性的检测——是否与其他抗原有交叉反应抗体效价的测定抗体亚类的鉴定——IgG（IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3），IgM抗体亲和力分析识别表位分析三、单克隆抗体制备

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产单克隆抗体的扩大生产细胞培养法（50μg/ml）小鼠体内诱生法（mg/ml）生物反应器（g/10L）细胞培养法杂交瘤细胞培养瓶或罐中培养收集上清液纯化抗体动物体内诱生法Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷腹腔内接种杂交瘤细胞收集腹水生物反应器单抗制备常见问题污染：培养环境、操作融合细胞不生长：PEG、血清、HAT培养基抗体分泌不足：支原体污染、细胞突变、

培养体系有问题杂交瘤细胞难以克隆化：血清质量、细胞活性第一节 多克隆抗体制备技术第二节 单克隆抗体制备技术第三节 基因工程抗体制备技术第四节 抗体库技术

第六章 抗体制备技术

基因工程抗体基因工程抗体优点原核表达抗体人源化小分子抗体双功能抗体易于改造亲和力成熟产业化第三节基因工程抗体制备技术

一、鼠源抗体人源化二、小分子抗体三、抗体融合蛋白第三节基因工程抗体制备技术

一、鼠源抗体人源化二、小分子抗体三、抗