第三章 基因操作的主要技术原理

第三章基因操作的主要技术原理第一节核酸的分离与纯化核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的方式存在的真核生物95%DNA存在于细胞核内，5%在细胞器75%的RNA存在于细胞质，10%在核内，15%在细胞器rRNA（80～85%），tRNA及核内小分子RNA（10～15%），mRNA（1～5%）一、核酸分离提取的原则1.保证核酸一级结构的完整性

2.排除其它分子的污染

核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子将其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染降到最低排除其它核酸分子的污染

核酸提取的基本要求

尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏

减少化学因素对核酸的降解（过酸、过碱）

减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力、高温）

防止核酸的生物降解

提取核酸的一般程序:破碎细胞去除与核酸结合的蛋白质及多糖等去除其它核酸分子沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质纯化核酸核酸的质量评估（电泳、D260/OD280，酶切）二、质粒载体的分离与纯化

关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开依据：质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA提取过程中，染色体DNA断裂成片段(线状)，而质粒DNA仍保持超螺旋构型变性法提取质粒DNA的原理

在变性条件（碱性或高温)下，线状染色体DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起。当变性条件恢复时，质粒DNA迅速复性恢复天然构型，染色体DNA难以复性，交联形成不溶性网状结构，与变性的蛋白质和RNA缠绕在一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在于上清液中。碱变性法提取质粒DNA的步骤收集细胞沉淀加入溶液I(50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mMEDTA,4~5mg/mL溶菌酶）加入溶液II(0.2MNaOH,1%SDS)加入溶液III(3MNaAcpH4.8)离心除去沉淀，得含质粒DNA的上清液苯酚抽提去除蛋白质乙醇沉淀收集质粒DNA在强碱性环境中暴露时间过长，cccDNA可发生不可逆变性关键：尽可能地保持其高分子量细菌3300~4200kb酵母15,000kb果蝇1.65x105kb人3x106kb植物2x105~1x108kb天花病毒288kb痘病毒196kb三、染色体DNA的分离纯化CsCl密度梯度离心原理：CsCl介质密度为1.7g/cm3，超速离心后形成1～1.9052g/cm3的密度梯度EB（溴化乙锭）可嵌入DNA两条链的碱基对之间，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应线性或开环DNA分子，因其具有游离的末端而易于解旋，故可结合相当大量的EB直到达到饱和具有ccc结构的质粒DNA由于负超螺旋的存在阻止DNA解链，因而只能结合很少的EBDNA分子中结合EB越多，其浮力密度越小，因而形成不同的浮力密度得以区分

质粒质粒DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs

关键：防止内外源RNase的作用

四、RNA的分离与纯化RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围抗高温严寒(0~65℃均具活性，100℃也不能使之完全失活）抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性）酶活性不需要辅助因子存在范围广

解决办法：外源RNase：高温（干热180℃，4hrs），焦碳酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者带手套

内源RNase：高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等五、核酸的浓缩与贮存

沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其最大的优点是通过核酸沉淀来改变核酸的溶解缓冲液及重新调节核酸在溶液中的浓度，可去除溶液中某些可溶性的盐离子与杂质，在一定程度上纯化核酸沉淀DNA的最常用方法是在DNA溶液中加入1/10体积的3MNaAc（或KAc）和2倍体积的乙醇，放置15～30min，离心收集DNA沉淀，倒去上清液，加入70%的乙醇洗涤沉淀，去除残余的盐，再离心收集沉淀。

贮存DNA：溶于TE中，放置于4℃、-20℃、-70℃RNA：溶于0.3MNaAc(pH5.2)或ddH2O中，-70℃长期保存可以沉淀形式贮存于乙醇中，-20℃六、核酸的质量评估方法

核酸浓度的测定

ds-DNA：1OD260≈50μg/ml

ss-DNA&RNA：1OD260≈40μg/ml单链寡核苷酸：1OD260≈20μg/ml

核酸纯度的测定

DNA：A260/A280=1.8

若＞1.8，说明RNA未除尽＜1.6，蛋白质或酚未除尽RNA：A260/A280=2.0

＜2.0，蛋白质或酚未除尽第二节凝胶电泳一、核酸电泳的基本原理

核酸分子中的磷酸基团带负电荷，在电场中将向正极移动，通过凝胶的分子筛作用可以将不同大小和构型的核酸分子分离，分子量小的DNA，具有较紧密的构型，在凝胶中移动快；反之，分子量大的DNA移动慢

琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力

凝胶类型及浓度分辨DNA片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1

DNARNADNA蛋白质核酸电泳的染色剂和指示剂

指示剂

在电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程

琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%溴酚蓝1kb0.6kb0.2kb0.15kb二甲苯青蓝2kb1.6kb

染色剂

溴化乙锭（EB）：嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外光下呈现橙色荧光由于单链DNA、RNA中常存在自身配对的双链区，也可嵌入EB分子

EB是一种诱变剂，见光易分解在常规电泳中，DNA移动距离与分子量有关：分子量小的移动快，反之则慢大于20kb的DNA大分子，其移动距离与分子量无关。因为这些DNA分子要通过胶孔时必须发生变形，并沿分子长轴运动经过胶孔，它们都以相同速度前进，分辨率也就消失了。

三、脉冲场凝胶电泳在脉冲场凝胶电泳中，加在凝胶上至少有两个电场方向，使得DNA分子要不断地调整泳动方向，不同分子量大小的DNA分子用于改变泳动方向的时间不同，则可以得到分离脉冲场凝胶电泳

Pulsed-FieldGelElectrophoresis，PFGE

PFGE工作原理DNA松弛时间：大分子DNA改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与DNA分子量呈正相关（Tr）

DNA移动时间：DNA分子向前移动的时间（Tm）

电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（Tp）

分子量大的DNA分子所需的松弛时间长，分子量小的则短。由于脉冲时间是一个人为的固定值，那么用于向前移动的时间则随分子量大小而变化。分子量大的用于向前运动的时间少，移动距离就短，分子量小的用于向前运动的时间多，移动距离就长。Tp小=Tm小+Tr小

Tp大=Tm大+Tr大

Tp小=Tp大

Tr小<Tp小

，故Tm小>Tm大

，所以，S小>S大

显然，要使一个DNA样品中不同大小的DNA分子分离，脉冲时间应选在最大DNA分子所需的上限。

第三节DNA序列分析

1.双脱氧核苷酸链终止法Dideoxy-terminationsequencing

Sanger法基本原理：双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影

DNASequencingReactionsTheDNAsequencingrunissimilartothePCRrun.TherunmixincludesthetemplateDNA,Taqpolymerase,dNTPs,ddNTPs,andaprimer:asmallpieceofsingle-strandedDNA20-30ntlongthathybridizestoonestrandofthetemplateDNA.TherunisintitiatedbyheatinguntilthetwostrandsofDNAseparate,thentheprimersannealstothecomplementarytemplatestrand,andDNApolymeraseelongatestheprimer.

4differentDNAsynthesisreactionsarerunbeginsynthesisfromspecificprimingpointaddcomponentsforDNAsynthesis+specificddNTPforeachofthefourreactions…e.g.ddATPNo3’OH...ddCTPACCCTTGGMethodfromSaenger

ManualsequencingusesradiolabeleddATP(35-Sor33-P)tolabeltheDNA.

Thesampleisthensplitintofourtubes

eachwithanindividualddNTPpresent.

Thesamplesarethensubjectedtoacrylamidegelelectrophoresisfollowedbyautoradiography.DNA全自动测序PuttingItAllTogetherUsinggelelectrophoresistoseparateeachDNAfragmentthatdiffersbyasinglenucleotidewillbandeachfluorescentlytaggedterminatingddNTPproducingasequencingread.Thegelisreadfromthebottomup,from5’to3’,fromsmallesttolargestDNAfragment.屏幕显示的胶图RawAutomatedSequencingDataA5laneexampleofrawautomatedsequencingdata. Green: ddATP Red: ddTTP Yellow: ddGTP Blue: ddCTPSanger：荧光检测

377测序仪人类基因组计划测序的主力机型测序的主要设备上样走电泳编写样品清单全自动的测序仪器：MegaBace

华大基因研究中心(北京)

承担了人类3号染色体短臂上的约3000万对碱基的测序任务，使中国成为继美、英、日、德、法之后第六个加入"国际测序俱乐部"的国家。中心已建成了基因组学、蛋白质组学、生物信息学研究及产业化平台，拥有ABI377-96平板测序仪11台，MegaBACE1000毛细管测序仪70台。

TADA!!2001

TheHGPconsortiumpublishesitsworkingdraftinNature(15February),andCelerapublishesitsdraftinScience(16February).2.Maxam-Gilbert化学法

原理：DNA链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反应，然后发生1~2个碱基的脱落或取代，最后发生链断裂，不同位置断裂的DNA分子经凝胶电泳就可确定其核苷酸序列

4种反应体系中，化学试剂特异断裂DNA机制G反应：硫酸二甲脂使鸟嘌呤N7甲基化A＋G反应：甲酸使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷键被削弱，使嘌呤环被吡啶取代C+T反应：肼能裂解嘧啶环，进而导致其脱落C反应：在一定浓度的NaCl条件下，肼只对胞嘧啶起作用化学法测序的一大优点是不需要模板，引物和DNA聚合酶。待测DNA链的检测用32P末端标记

作业Asolutioncontainsdouble-strandedDNAfragmentsofsize3kb,6kb,9kb,and12kb.Theyareseparatedinanelectrophoresisgel.Inthediagramofthegelattheright,matchthefragmentsizeswiththecorrectbands.

AclonedfragmentofDNAwassequencedbyusingthedideoxymethod.ApartoftheautoradiogramofthesequencinggelisrepresentedhereDeducethenucleotidesequenceoftheDNAnucleotidechainsynthesizedfromtheprimer.Labelthe5′and3′endsDeducethenucleotidesequenceoftheDNAnucleotidechainusedasthetemplatestrand.Labelthe5′and3′endsWritethenucleotidesequenceoftheDNAdoublehelix(labelthe5′and3′ends)第四节

分子杂交技术核酸杂交Southern印迹杂交（Southernblotting）Northern印迹杂交（Northernblotting）Western印迹杂交（Westernblotting

）

Southern杂交Southern杂交是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术，用于特定DNA序列的检测，包括基因组特定DNA序列的定位，相关片段的同源性测定、从cDNA库、基因组文库中筛选目的基因等。用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。Southern印迹杂交的用途确定在克隆片段中基因编码区的大小和位置确定克隆片段在基因组中的拷贝数SouthernblottingSouthernblottingNorthernBlotting相对Southernblotting命名的，与Southernblotting不同的是，它检测的对象是RNA分子。

WesternBlotting杂交的对象是蛋白质，先将蛋白质从SDS中转移到一固相支持物上，通过与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异反应进行检测

主要用于基因的表达产物蛋白质的检测第五节PCR技术一、PCR技术的基本原理

Polymerasechainreaction,PCR

聚合酶链式反应

AmethodforamplifyingspecificDNAsegmentsthatexploitscertainfeaturesofDNAreplication.一个DNA经n次扩增后,一个DNA分子可变为2n

理论上经过30次循环，靶DNA得到109倍的扩增，实际是106~7倍的扩增DNA扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物二、PCR反应的各种组份及作用

一个标准的PCR反应体系（50~100μl）

50mmol/LKCl10mmol/LTris-HCl（pH=8.4）1.5mmol/LMgCl2100μg/ml明胶或牛血清白蛋白（BSA）2个引物，各0.25μmol/LdNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP）各200μmol/L模板DNA（人基因组DNA）0.1~1μgTaqDNA聚合酶2UDenaturation94℃,0.5minPrimerannealing55℃,1.5mionExtension72℃,1min30cycles变性（模板）－退火（引物与模板）－延伸（新合成DNA链）1.模板DNA用于PCR扩增的模板DNA通常是从细胞中提取的染色体DNA，它们并不需要高度纯化。待扩增的靶DNA的长度在3kb以下是PCR的有效扩增范围，采用经改造的TaqDNA聚合酶可扩增出40kb的DNA片段。

2.引物PCR引物是与待扩增的目的DNA两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段引物的长度通常为17~30个核苷酸

引物太短，可能同非靶DNA杂交，得出非预期的扩增产物；引物太长，引物与模板的结合效率降低，影响扩增效率。

如8nt的引物，平均每48=65536bp就会有一个结合位点，在全长为3×109

bp的人类基因组中，大约有43000个可能的结合位点，不能得到单一的特异性扩增产物。如为17nt的引物，出现几率为417=17,179,869,184bp，长度超过人类基因组长度的5倍，故在人类基因组中只可能有一个结合位点。但引物不是越长越好，过长的引物同模板DNA的杂交效率反而下降，从而降低PCR反应的效率。简并引物

是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间只有一个或数个核苷酸的差异。如根据氨基酸序列推测出的核苷酸序列。引物与复性温度

引物与模板结合的特异性与复性温度有密切关系当复性温度偏低时，引物与模板配对出现错配碱基，导致一些不需要的DNA片段被扩增复性温度过高，引物与模板不能配对复性温度常与引物的长度和碱基组成有直接关系，引物越长或GC含量较高，退火的温度可以高些，反之则低些Tm=4×(G＋C)＋2×(A＋T)℃1~2℃below引物设计的一般原则:

Correspondwiththesequencesflankingthetargetregiononthetemplatemolecule.

引物的长度常为17~30GC含量为40%~60%Tm值高于55℃两条引物间配对碱基数小于5个引物自身配对(特别是在引物的3’端)形成的茎环结构,茎的碱基配对数不大于3

通常采用计算机辅助设计3.dNTP

浓度为20~200μmol/L，4种dNTP以等摩尔浓度配制浓度过高，加快反应速度，但可增加碱基的错误掺入率和成本浓度过低，反应速度下降，提高实验的精确性4.TaqDNA聚合酶

基本特点:TaqDNA聚合酶是从