第10章 分子杂交技术hu

第十章分子杂交技术

南昌大学生命科学学院

胡宝庆Email:baoqinghu@Tel/p>

定义：用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。

待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。特点：灵敏度高（<1pg互补序列）速度快（<24h）简单易行应用：基因克隆的筛选酶切图谱制作基因组中特定基因序列的定量和定性检测基因突变分析疾病的诊断、微生物病原体检测第一节核酸杂交基本原理 第二节核酸探针标记的方法第三节几种常见的杂交第四节其他类型杂交介绍第五节原位杂交分子杂交(简称杂交，hybridization)是核酸研究中一项最基本的实验技术。原理：应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA(或RNA)片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子(heteroduplex)。杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。杂交的本质就是在一定条件下使互补核酸链实现复性。因此，变性技术也是核酸杂交的一个环节。第一节核酸分子杂交的基本原理1、变性：

在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。

引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。

A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（meltingtemperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含量有关。

Tm=（G+C）%×0.41+69.3Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。

2、复性在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。复性过程：第一步是两条单链随机碰撞形成局部双链，这种局部的双链是暂时的，若周围的碱基不能配对就会重新解离，一旦找到正确的互补区，则其局部双链形成核（成核反应），然后核两侧的序列迅速配对，形成完整的双链分子。影响复性的因素单链核酸的起始浓度：反应开始时的总浓度可直接影响单链分子碰撞的几率，浓度越高，复性越快。核酸链长度（分子量）：分子越长，扩散越慢，形成配对的难度也大，复性也慢。核酸分子的复杂性：复杂性即核酸分子中不同序列的总长度，复杂性越高，形成正确配对的难度也越大，复性越慢。温度：温度过高有利于变性；过低则分子运动减慢，少数碱基形成的局部双链也不易解离。适宜的复性温度是比Tm低25℃。离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于复性。离子强度过高则不利于复性。分子杂交的基本过程1、样品制备从待检样品提取DNA或RNA。DNA先用酶消化成大小合适的片段，然后用凝胶电泳进行分离，再将含DNA片段的凝胶做变性处理，转膜固定。RNA样品可直接在变性条件下电泳分离，然后转膜固定。2、探针制备作为探针的已知DNA或RNA片段一般为30-50bp，探针上需标记上可直接检测的元素或分子。3、杂交将处理后结合在硝酸纤维素膜上的待检样品与溶液中的标记探针进行杂交，杂交前要进行预杂交，即用非特异性核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。4、检测依据标记探针的方法而异，用放射自显影或免疫组化的方法来进行检测。影响核酸分子杂交的因素：探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越高，配对难度也增大。离子强度：高离子强度溶液中，正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，削除相互间的静电斥力，有利于杂交分子形成。温度：通常在低于Tm20-25℃的温度下进行杂交。添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸等，因其表面可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而加速杂交反应。杂交条件的严谨性：指杂交反应体系中，避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。它主要与杂交反应的温度、离子强度和洗膜的温度有关。实际操作时，一般采用较低严谨性杂交以提高反应速率，以较高严谨性洗膜以尽量洗去非特异性结合和配对较差的探针，以提高特异性。预杂交

为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂前的这些处理过程称为预杂交。常用于预杂交的封闭物：变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。一、核酸探针定义：核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特殊的标记物。第二节核酸探针标记的方法核酸探针的类型：

1、寡核苷酸探针

2、基因组DNA探针

3、cDNA探针

4、RNA探针

5、单链DNA探针

1、寡核苷酸探针：由实验者设计、经核苷酸合成仪合成。目前的合成仪均可合成70-100bp长的寡核苷酸，但一般常用的寡核苷酸针长18-30bp。优点：（1）制备方便，实验者可根据需要自行设计，避免了天然核酸探针存在的高度重复序列。（2）由于大多数寡核苷酸探针长度只有15-30bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响影响其熔解温度。因此它特别适用于基因点突变分析。（3）比活度高，适用于大多数杂交，如DNA序列测定、Sounthern、Northern原位杂交等。

缺点：探针短，与靶序列形成的杂交体稳定性差，对杂交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难度大；探针特异性差，背景噪音也大。2、基因组DNA探针：利用机械剪切或限制性内切酶消化基因组DNA制备成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当的载体中，转化宿主细胞，构建成基因组DNA文库，进而在文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆，经扩增、提取DNA、酶切及电泳分离，即可得到足够量的基因片段，经适当的标记后，即可作为探针使用。PCR方法也可制备DNA探针。在选择此类探针时要特别注意真核基因组中存在的高度重复序列。要尽可能使用基因的编码顺序（外显子）作为探针，而避免使用内含子及其它非编码顺序，否则探针中可能因高度重复序列存在引起非特异性杂交而出现假阳性。

3、cDNA探针：由mRNA转录而来，在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板，合成cDNA第一链，进而合成第二链。将合成的cDNA插入到适当的载体中，构建cDNA文库，然后筛选适当的阳性克隆，再进一步扩增、酶切及纯化该cDNA片段即可。也可利用反向技术制备，即以mRNA为模板逆转录合成第一链cDNA，然后加入一对相应于目的序列两端的PCR引物进行PCR扩增，再电泳分离、纯化，即可得到特定的cDNA片段。优点双链探针，长度较长，可与靶序列形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高，杂交信号强。缺点由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过程中还存在自我复性现象。

4、RNA探针：

以双链DNA为模板，利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶于体外转录而成。优点①RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高。②单链，不存在变性和自我复性。③RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交少。④杂交后可用RNase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。缺点

RNA容易降解。5、单链DNA探针：

利用M13噬菌体载体合成。优点无自我复性现象。缺点需再克隆到M13载体中杂交体不如RNA探针稳定技术难度大探针所携带的标记物应具备的条件：标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。稳定性好、环境污染少、价廉。常用的探针标记物：放射性同位素：

3H、32P、35S、125I等。非放射性同位素：地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。常用的探针标记法：1、切口移位(平移)法2、引物延伸法3、末端标记法4、PCR法1切口平移法(nicktranslation)当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3‘羟基末端。该酶同时具有从5’→3‘的核酸外切酶活性，能从切口的5’端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3‘端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口移位（平移）法切口平移法现基本上被随机引物法取代。切口平移法存在的主要问题是难以平衡反应中的DNA酶Ⅰ和

DNA聚合酶Ⅰ的活性，切口过多会产生过多的起始位点，导致大量的放射性标记物的掺入，但产生过短的片段，切口过少则使切口平移起始位点数目受限，而产生低比活性的产物。2引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400-600个核苷酸。优点：(1)Klenow片段没有5‘→3’外切酶活性，反应稳定，可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高，可达4×109cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。随机引物标记示意图

用T4多核苷酸激酶标记DNa5’末端寡核苷酸探针或短的RNA和DNA探针可选用此法标记，寡核苷酸探针一般多用这种标记。T4多核苷酸激酶（polynucleotidekinase,PNK）是由T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷酸转移至DNA或RNA的5’－OH末端。在过量ADP存在时，也可促进磷酸交换反应，使PNK将DNA末端5’磷酸转移到ADP上生成ATP，然后催化[α-32P]dNTP上的标记磷酸转移至DNA的5’末端，从而使DNA重新磷酸化，并藉此得到标记。显然，PNK标记DNA末端需要[γ-32P]dNTP，这与前述酶促标记方法不同。通常，对于5’磷酸化的DNA探针，要先用碱性磷酸酶去掉磷酸基团，然后再用于PNK催化的5’末端标记，这样标记效率较高。

3、末端标记法末端标记法4PCR标记法：

在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记的dNTP，这样标记的dNTP就可在PCR反应的同时掺人到新合成的DNA链上。

四、探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是SephadexG-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针第三节几种常见的杂交3.1Southern杂交3.2Northern杂交3.3菌落杂交法colonyhybridizationmethod3.4噬菌斑杂交法plaquebybridization3.5western杂交一、类型：根据反应环境分为1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定 在固体支持物上，另一条核酸 链游离在液体中。2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游 离在液体中。二、固体支持物种类硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠、微孔板等。选择原则：①具有较强的结合核酸的能力；②与核酸的结合比较稳定③尽量少的非特异性吸附5.1Southern杂交(以哺乳动物基因组DNA为例)一、待测核酸样品的制备（一）制备待测DNA基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3.用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。（二）DNA限制酶消化基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。二、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品（一）基本原理Southern印迹杂交是先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片断长短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。另外为了便于测定待测DNA分子量的大小或是所处的分子大小范围，往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量DNA（DNAmarker）进行电泳。（二）基本步骤1.制备琼脂糖凝胶，尽可能薄。DNA样品与上样缓冲液混匀，上样。推荐使用的靶基因的上样量见不同条件下上样本的使用指针比较表。一般而言，对地高辛杂交系统，所需DNA样品的浓度较低，每道加2.5-5μg人类基因组DNA；如果基因组比人类DNA更复杂（如植物DNA）则上样量可达10μg；每道上质粒DNA<1ng。2.分子质量标志物（DIG标记）上样。3.电泳，使DNA条带很好的分离4.评价靶DNA的质量。在电泳结束后，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min，紫外灯下观察凝胶。三、电泳凝胶预处理（一）原理DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构。为了进行有效地实现Southern印迹转移，对电泳凝胶做预处理十分必要。分子量超过10kb的较大的DNA片段与较短的小分子量DNA相比，需要更长的转移时间。所以为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段控制在大约2kb以下。DNA的大片段必须被打成缺口以缩短其长度。因此，通常是将电泳凝胶浸泡在0.25mol/L的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理之后，移至于碱性溶液中浸泡，使DNA变性并断裂形成较短的单链DNA片段，再用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。这样，DNA片段经过碱变性作用，亦会使之保持单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。（二）基本步骤1.如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理。(1)把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动，直到溴酚蓝从蓝变黄。注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植物基因组DNA≤20分钟。(2)把凝胶浸在灭菌双蒸水中2.如果靶序列<5kb，则直接进行下面的步骤(1)把凝胶浸在变性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中，室温2×15分钟，轻轻晃动。(2)把凝胶浸在灭菌双蒸水中(3)把凝胶浸在中和液中（0.5mol/LTris-HCl，pH7.5，1.5mol/LNaCl），室温2×15分钟。(4)在20×SSC中平衡凝胶至少10分钟。四、转膜即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。DNA是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印迹（blotting）。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是NC膜和Nylon膜.五、探针标记用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。人工合成的短寡核苷酸可以用T4多聚核苷酸激酶进行末端标记。探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法。六、预杂交（prehybridizafion）将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。但其中主要含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针DNA杂交）、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。具体步骤如下：一）配制预杂交液：6XSSC，5XDenhardt’s试剂，0.5%SDS，50%(v/v)甲酰胺，ddH2O，100ug/ml鲑鱼精DNA变性后加入。注：1.每平方硝酸纤维素膜需预杂交液0.2ml。2.预杂交液制备时可用或不用poly(A)RNA。3.当使用32P标记的cDNA作探针时，可以在预杂交液或杂交液中加入poly(A)RNA以避免探针同真核生物DNA中普遍存在的富含胸腺嘧啶的序列结合。4.按照探针、靶基因和杂交液的特性确定合适的杂交温度（Thyb）。（如果使用标准杂交液，靶序列DNAGC含量为40%，则Thyb为42℃。）（二）把预杂交液放在灭菌的塑料瓶中，在水浴中预热至杂交温度。（三）将表面带有目的DNA的硝酸纤维素滤膜放入一个稍宽于滤膜的塑料袋，用5-10ml2×SSC浸湿滤膜。（四）将鲑鱼精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。（五）从塑料袋中除净2×SSC，加入预杂交液，按每平方滤膜加0.2ml。（六）加入变性的鲑鱼精DNA置终浓度200μg/ml。（七）尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，上下颠倒数次以使其混匀，置于42℃水浴中温育4h.七、Southern杂交（一）原理转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针DNA（探针DNA预先经加热变性成为单链DNA分子），即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜，然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。（二）步骤1.将标记的DNA探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。2.从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋，剪开一角，将变性的DNA探针加到预杂交液中。3.尽可能除取袋中的空气，封住袋口，滞留在袋中的气泡要尽可能地少，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污染的塑料袋内。4.置42℃水浴温育过夜（至少18h）。八、洗膜取出NC膜，在2XSSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：2×SSC/0.1%SDS，42℃，10min，1S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min，0.5S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min，0.2×SSC/0.1%SDS，56℃，10min，0.1×SSC/0.1%SDS，56℃，10min。采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交还需注意的关键一步就是洗膜。在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。九、放射性自显影检测（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。（二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶代固定，合上暗盒。（三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。（四）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱，则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。（注：注意同位素的安全使用）杂交流程示意图Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素,包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下，放射自显影曝光数天后，Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32P标记的高比活性探针的(>109cpm/μg)互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交，曝光过夜，则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。Southern杂交的用途：进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组DNA的定性、定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析。DNA从凝胶中转移到固体支持物上有3种方法:(1)毛细管转移本方法由Southern发明，故又称为Southern转移(或印迹)。优点：简单，不需要用其他仪器。缺点：转移时间较长，转移后杂交信号较弱。(2)真空转移将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上，再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流下，洗脱出凝胶中的DNA，使其沉积在滤膜上。优点：快速，在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点：如不小心，会使凝胶碎裂,并且在洗膜不严格时，其背景比毛细转移要高。(3)电泳转移将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。优点:不需要脱嘌呤/水解作用，可直接转移较大的DNA片段。缺点：转移中电流较大，温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时，才采用电泳转移5.2Northern杂交Northern印迹杂交（Northernblot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Westernblot。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在上样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法<1>试剂10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/LEDTApH8.0。5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4%溴酚蓝。甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。20×SSC；去离子甲酰胺；50mmol/LNaOH(含10mmol/LNaCl)；0.1mol/LTris，pH7.5。<2>步骤[1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7ml10×MSE缓冲液，11.5ml甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。

[2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。[3]使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。

[4]55℃加热15min，冰浴冷却。

[5]加2ml5×载样缓冲液。

[6]上样、同时加RNA标记物（同位素（32P）dCTP）。

[7]60伏电泳过夜。

[8]取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。

[9]室温下将胶浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。

[10]室温下将胶浸到0.1mmol/LTrisHCl(pH7.5)中45min,使胶中和。

[11]20×SSC洗胶1h。

[12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。[13]取出硝酸纤维素膜，80℃真空烘烤2h。在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。从琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化汞是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。5.3菌落杂交法colonyhybridizationmethod对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100~200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板，第二个琼脂平板表面铺一张硝酸纤维素滤膜。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。5.4噬菌斑杂交法plaquebybridization噬菌体为载体进行DNA克隆繁殖时所常用的方法。把基因组中含有特定碱基序列的噬菌体，通过核酸杂交，从多数噬菌体的噬菌斑中选出的方法。将在琼脂培养基上形成的噬菌体的噬菌斑，移于硝酸纤维素滤纸上，碱处理使噬菌体DNA变性；DNA固定于硝酸纤维素滤纸上，与用放射性同位素标记的特定的RNA或DNA片段进行杂交；通过放射自显影法来识别含有所需DNA序列的噬菌体的噬菌斑，并从原来的琼脂培养基中选出与其对应的噬菌斑。5.5斑点杂交（dothybridization）斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释，还可以得到半定量的结果。简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法，在基因分析和基因诊断中经常用到，是研究基因表达的有力工具。目的序列未与非目的序列分离，不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时，难以区分目的序列信号和干扰信号。5.5.1DNA斑点杂交①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上，每个样品一般点5μl(2~10μgDNA)。④将膜烘干，密封保存备用。5.5.2RNA斑点杂交与DNA斑点杂交类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化）方法：将RNA溶于5μlDEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。细胞标本处理技术可以简化，不用提取和纯化RNA。方法：用含0.5%NonidetP40的低渗缓冲液对多种动物细胞作简单处理，离心去掉细胞核和细胞碎片，就得到基本不带DNA而富含RNA的细胞质提取物，这一粗RNA在高盐下用甲醛变性，不需加工直接点到硝酸纤维素膜上。本法可以快速检测大量标本，而只需极少量的细胞（5×104）或组织。整个RNA实验中，要防止激活内源性RNase，有许多种预防措施，有一种是在样品中加入核糖核苷氧矾基复合物（RVC）。5.5.3完整细胞斑点杂交类似检测细菌菌落，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交。不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。五、Western杂交

Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。Western

杂交技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序SouthernBlot相似，故称为WesternBlot,第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶)来检测，此方法可检测1ng抗原蛋白。Western杂交方法灵敏度高，通常可从植物总蛋白中检测出50ng的特异性的目的蛋白。试剂配制(1)转移电泳缓冲液：20mmol/LTrisHCLpH8.0150mmol/L

甘氨酸加14.5gTris粉67.08g甘氨酸于4L水中，加入1200mL甲醇，加水至6L(2)丽春红S溶液：0.5%丽春红S1%乙酸操作步骤(1)用已制备好的SDS分离的蛋白凝胶。(2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-BritPad上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-BritPad。(4)将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置中，加入电转移缓冲液。(5)接通电源：使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电压为14V4℃转移4小时或过夜。(6)将滤膜放入丽春红S溶液中5分钟，蛋白染色水中脱色2分钟，照像，用印度墨水将分子量标准染色，在水中完全脱色。(7)将滤膜放在塑料袋中，每3张加入5mL封闭缓冲液(1克速溶去脂奶粉溶于100mlPBS中)，封闭特异性抗体结合位点，室温1h，摇动，倒出封闭缓冲液。(8)在封闭缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置1小时，将滤膜转到塑料盒中，用200mLPBS洗四次，摇动。(9)在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤8。(10)将滤膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大约2～3分钟就可显色，用水冲洗终止反应、照像。结果分析：分析阳性(显色)条带的分子量大小，而且根据信号(颜色)强弱分析蛋白表达量WestBlot杂交（一抗与特定蛋白结合）漂洗去除多余的一抗二抗与一抗结合漂洗去多余的二抗结果检测第四节原位杂交4.1原位核酸分子杂交技术的发展4.2原位分子杂交技术的基本方法4.3RNA原位核酸杂交4.4双重原位杂交方法4.5原位杂交的PCR增敏法4.6原位杂交的CSA增敏法原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(insituhybridizationISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体；然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。4.1原位核酸分子杂交技术的发展1969年，美国耶鲁大学Gall和Pardue创立原位杂交，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，BuongiornoNardelli和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。1970年，Orth应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位。1981年，Bauman等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。1982年，Shroyer报道用2，4二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶标抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶组织化学的方法显示杂交信号。1983年，Brigat首先建立生物素标记的探针在组织切片上检出了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位，生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。1987年，地高辛标记的有关试剂及药盒被投放市场，和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶显色系统)，有较好的反差背景，更有利于与免疫组织化学相结合，同时可以检测基因表达。4.2原位分子杂交技术的基本方法原位杂交技术的基本方法包括：①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理；④显示(visualization)：包括放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色。4.2.1固定固定的目的是为了保持细胞形态结构，最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，那么，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。(1)最常用多聚甲醛固定组织，因其不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，不会影响探针穿透入细胞或组织。(2)醋酸-酒精的混合液和Bouin′s固定剂也能获得较满意的效果。(3)mRNA定位，将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1~2h，冷冻前浸入15%蔗糖溶液置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。(4)组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。如冰箱温度恒定，在-70℃切片可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理学活检取材时多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号；石蜡包埋切片由于与蛋白质交联的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。各种固定剂均有各自的优缺点：沉淀性(Precipitating)固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin′s液、Carnoy′s液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存RNA，而且对组织结构有损伤。戊二醛较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交联，从而大大地影响了核酸探针的穿透性。4.2.2玻片和组织切片的处理

玻片的处理玻片包括盖片和载玻片应用热肥皂水刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干、烘箱温度最好在150℃或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。常用的粘附剂有铬矾明胶液，其优点是价廉易得，粘附效果较差。多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果，但价格昂贵。新粘附剂APES粘附效果好，价格较多聚赖氨酸便宜，制片后可长期保存应用。

增强组织的通透性和核酸探针的穿透性增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂(detergent)或称清洗剂TritonX100、酒精或某些消化酶如蛋白酶K，胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。这种广泛的去蛋白作用无凝可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存量和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应填为掌握。

减低背景染色背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐和三乙醇胺中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。预杂交是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。在杂交后洗涤中采用低浓度的RNA酶溶液(20μg/ml)洗涤一次，以减低残留的内源性的RNA酶，减低背景染色。

防止RNA酶的污染由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温(240℃)烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶，其最低温度必需在150℃左右。4.2.3杂交杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片，或采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片，加盖片防止孵育过程中杂交液的蒸发。在盖玻片周围加液体石蜡封固或加橡皮泥封固。硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触，盖玻片自身有一定重量能使有限的杂交液均匀覆盖。可将复有硅化盖玻片进行杂交的载玻片放在盛有少量5×SSC或2×SSC(standardsalinecitrate,SSC)溶液的湿盒中进行孵育。4.2.4杂交后处理(Posthybridisationtreatment)杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。大多数的原位杂交实验是在低严格度条件下进行的，非特异性的探针片段粘附在组织切片上，从而增强了背景染色。RNA探针杂交时产生的背景染色特别高，能通过杂交后的洗涤有效减低背景染色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。4.2.5显示(Visualization)显示又可称为检测系统(Detectionsystem)。根据核酸探针标记物的种类分别进