黄芪对糖尿病肾病大鼠nf-b、mcp-1表达的影响

黄芪对糖尿病肾病大鼠nf-b、mcp-1表达的影响

糖尿病性肾衰竭（dn）是糖尿病的严重并发症之一。DN的发病机制至今尚不清楚,目前认为糖代谢紊乱、肾局部血流动力学改变、细胞因子等因素均发挥着重要的作用。NF-κB为一种与炎症介质的产生、细胞增生、细胞外基质交联和细胞凋亡有关的转录因子。NF-κB的活化可上调细胞因子的表达和细胞外基质(ECM)合成。因此,NF-κB可能与DN的发病相关。我们知道黄芪能促进肝脏合成白蛋白,但也有研究表明其能减糖尿病肾病的蛋白尿,但其机制不清。本实验将探讨NF-κB在糖尿病肾病大鼠肾组织中的变化及黄芪对NF-κB表达的影响及其对糖尿病大鼠肾脏是否有保护作用。1材料和方法1.1动物血糖正常雄性Sprague-DTwley(SD)大鼠共30只,体重210~240g(贵州省动物中心提供),血糖正常。试剂:链脲佐菌素(STZ,Sigma公司),(贵阳同济堂药店),单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)抗体、NF-κBP65抗体,SABC试剂盒(武汉博士德公司)。1.2方法1.2.1糖尿病大鼠+黄芪大鼠随机分成3组,每组10只,分别为C组(正常对照组);DM组(糖尿病组);DT组(糖尿病大鼠+黄芪治疗组)。糖尿病模型建立后,DT组予黄芪10g/(kg·d)灌胃,DM组及C组喂予等量饮用水。实验期间大鼠自由饮水、进食,不使用胰岛素及其他降糖药物。1.2.2糖尿病大鼠模型的建立1.3样品收集和处理1.3.1生化指标测定20℃冷藏待测;股动脉放血5mL,叶素抗凝(1mL血加125个U),测定生化指标;处死大鼠,迅速取出右肾,4℃生理盐水冲洗2次,小心剥去肾包膜,肾组织横切为约1mm的薄片,置4%多聚甲醛缓冲液中固定,行免疫组化及肾形态学观察。1.3.2指标的测定雅培2000型自动生化分析仪测定血浆肌酐(Cr)、雅培2000生化测定仪测定24h尿蛋白。1.3.3免疫组织化学法测定了肾组织中nf-b和mcp-1的发现参照文献的方法测定肾组织NF-κB和MCP-1的表达。1.4肾组织的染色肾组织切片苏木素—伊红(HE)和过碘酸(PAS)染色。HE染色后细胞核呈蓝色,细胞浆呈红色。PAS染色后糖原呈红色,胞核呈淡蓝色。1.4.1小鼠肝肾nf-b、mcp-1、nf-b、mp-1、cp-1、mcp-1的表达情况每例标本按左上、左下、右上、右下、中间顺序取肾皮质20个肾小球,高倍视野下(×400)分别观察肾小球中NF-κB(细胞核呈棕褐色)、MCP-1(细胞浆呈棕褐色)阳性细胞数,均值表示每例肾小球中阳性细胞数。1.4.2统计分析实验结果以表示,应用SPSS10.0软件进行统计学处理,组间比较采用t检验,相关分析采用直线相关。P<0.05为差异有显著意义。2结果2.1dt组小鼠血清nf-b阳性细胞数的比较C组肾小球中可见少量NF-κB的表达,DM组肾小球NF-κB阳性细胞数较C组明显增高(P<0.01),DT组肾小球中NF-κB阳性细胞数较DM组减少,差异有显著意义(P<0.05);MCP-1在C组肾小球中可见极少量表达,DT组肾小球MCP-1阳性细胞数与DM组比较差异有显著意义(P<0.05),见表1。2.2血胱蛋白和24h尿蛋白与C组比较,DM组血肌酐和24h尿蛋白明显增高(P<0.01),DT组血肌酐和24h尿蛋白较DM组明显下降(P<0.05),见表2。2.3dt组大鼠小鼠系膜区基质厚度的变化HE及PAS染色光镜观察,C组未见明显病理改变,DM组大鼠肾小球系膜区基质中度增多,系膜细胞中度增生,小管间质散在灶性单个核细胞浸润,DT组上述病理改变均有不同程度的减轻,见图1,图2,图3,图4。2.4肾衰竭p-b阳性细胞数与血液肌腱、24小时尿蛋白之间的相关分析肾小球NF-κB阳性细胞数与血肌酐、24h尿蛋白量呈明显正相关,r值分别为0.79(P<0.05)和0.80(P<0.05)。3糖尿病大鼠肾组织中nf-b的变化情况糖尿病的发病率逐年上升,且糖尿病肾病一旦进展至临床蛋白尿期,则不可避免发展到终末期肾衰,因此,对早期糖尿病肾病进行干预有重要意义。NF-κB是一种介导细胞内信号转导的转录因子,由多肽链p50和p65两个亚基组成。细胞静息状态下,NF-κB的p65亚基和其抑制性蛋白IκB形成复合物留在胞浆中,NF-κB处于失活状态。当细胞受到刺激时IκB和NF-κB解离,随即NF-κB进入细胞核内,参与基因转录,从而在机体的免疫应答、炎症反应和细胞生长发育等方面发挥作用。许多与肾脏疾病进展有关因子如MCP-1、粘附因子等的基因启动子中含有NF-κB结合位点,提示NF-κB可能在肾脏疾病的发病中起重要作用。Donadalli等研究发现,在肾毒血清性肾小球肾炎中随着NF-κB的活化,MCP-1、ICAM-1表达增高,尿蛋白也增加,间质ED1+的单核细胞和CD8T+细胞的趋化作用也与NF-κB活性相平行。本实验结果显示,正常大鼠肾组织中NF-κB有较弱的活化,提示适量的NF-κB活化可能是调节正常肾脏细胞生理功能所必须。与正常大鼠相比较,有肾脏损害的糖尿病大鼠肾小球中NF-κB、MCP-1明显升高,糖尿病大鼠24h尿蛋白和肌酐亦明显增高,糖尿病大鼠肾组织中NF-κB表达与24尿蛋白和肌酐呈明显正相关,表明DN时肾组织中NF-κB被异常激活,且NF-κB表达与DN的严重程度密切相关。DN的发生发展是多因素综合作用的结果,而NF-κB的异常激活,上调细胞因子(如MCP-1、VCAM-1等)的表达及促进细胞外基质合成可能是其发生发展的重要环节。近年的研究发现DN肾组织病变周围常有大量单核细胞浸润,浸润的单核巨噬细胞通过分泌细胞因子、炎症介质及产生氧自由基促使细胞外基质增加和小管间质纤维化,加速肾小球硬化的进展。目前认为,MCP-1是介导单核巨噬细胞浸润的主要因子,而MCP-1的转录合成是由NF-κB调控。因此,NF-κB的异常活化可能是引起MCP-1表达增加的主要因素。我们在本研究中发现,糖尿病大鼠肾组织中NF-κB活化和MCP-1表达明显增加,肾小球系膜区基质增多,肾小球和肾小管基底膜增厚,系膜区扩张,小管间质散在灶性单个核细胞浸润及成纤维细胞增生。PAS染色肾小球阳性基质面积比增高。由此表明,糖尿病时活化的NF-κB通过上调肾组织MCP-1表达,促进单核巨噬细胞肾组织浸润,导致细胞外基质增加可能是DN发生发展的重要机制之一。黄芪是减少蛋白尿的常用中药之一,研究认为黄芪能减轻糖尿病大鼠早期肾脏肥大,降低微量白蛋白的排泄,同时观察到在免疫性肾炎鼠中,黄芪可减轻NF-κB表达的同时也降低肿瘤坏死因子(TNF)水平,下调肾组织中MCP-1的蛋白量及mRNA的过度表达,从而抑制免疫反应而发挥治疗作用。我们的研究表明黄芪也能使糖尿病肾病大