细菌形态学检查课件

第二章细菌形态学检查第二章细菌形态学检查2二细菌染色标本的检查三显微镜概述一细菌不染色标本的检查2二细菌染色标本的检查三显微镜概述一细菌不染色标本的检查3一、显微镜概述

显微镜（microscope）

显微镜是由一个透镜或几个透镜的组合构成的一种光学仪器，主要用于放大微小物体成为人的肉眼所能看到的仪器。3一、显微镜概述显微镜（microscope）4光学显微镜以自然光或灯光为光源，在最佳条件下最大分辨率为0.25μm，可以清楚的观察到细菌、寄生虫等个体。4光学显微镜以自然光或灯光为光源，在最佳条件下最大分5暗视野显微镜

用特制的暗视野集光器代替普通光学显微镜上的明视野集光器，故背景视野黑暗无光。常用于观察活细菌、螺旋体、寄生虫的运动现象。5暗视野显微镜6相差显微镜

根据标本中密度不同引起光相差异的原理观察病原生物，主要用于检查不染色病原生物的形态及某些内部结构。6相差显微镜7荧光显微镜

病原生物经荧光染色后，置于荧光显微镜下可激发荧光，可以看到发射荧光的各种病原生物。7荧光显微镜8电子显微镜

是以电子流代替光源，能分辨1nm物体，又分为透射电子显微镜和扫描电子显微镜。8电子显微镜9二、细菌不染色标本的检查9二、细菌不染色标本的检查101、悬滴法(a)在洁净盖玻片周围涂少许凡士林。(b)在盖玻片中央滴一小滴菌液。(c)将凹玻片反转，使凹窝中心对准盖玻片上的菌液滴，液滴不得与凹玻片接触，轻压使盖玻片与凹玻片粘在一起，液滴处于封闭的小室中，防止液滴干燥和气流的影响。101、悬滴法11(d)小心将凹玻片翻转过来，使菌滴仍悬浮在盖玻片下和凹窝中心。

(e)先用低倍镜找到悬滴边缘，再用高倍镜观察，观察时光线要调得

暗一些。11(d)小心将凹玻片翻转过来，使菌滴仍悬浮在盖玻片下和凹窝122、压滴法(a)制备菌悬液：取出1ml菌液稀释至肉眼看不到混浊为止。(b)取2-3环稀释菌液，放在载玻片中央。(c)用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻

片慢慢放下，注意不要产生气泡。(d)先以低倍镜找到标本，再用高倍镜观察，观察时光线要调得暗些。122、压滴法13三、细菌染色标本的检查1、革兰染色2、抗酸染色3、荧光染色13三、细菌染色标本的检查1、革兰染色141、革兰染色

（Gram

stain）

染色原理：

通过结晶紫初染和碘液媒染，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次多且致密，遇乙醇或丙酮脱色处理时，能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰阴性菌在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，结晶紫与碘复合物的溶出，通过脱色后呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革阴性菌呈红色。141、革兰染色（Gramstain）15操作方法：1）涂片固定。2）草酸铵结晶紫染1分钟。3）用蒸馏水冲洗。4）加碘液覆盖涂面媒染约1分钟。

15操作方法：165）水洗，用吸水纸吸去水分。6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。7）稀释复红或沙黄复染2分钟后，水冲洗。干燥，镜检。

165）水洗，用吸水纸吸去水分。17镜检结果：革兰染色阳性细菌（紫色）革兰染色阴性细菌（红色）17镜检结果：革兰染色阳性细菌革兰染色阴性细菌18临床意义：1）细菌鉴定，分为革兰染色阳性和阴性两类。2）根据细菌染色性质初步确定致病物质。3）参考选择抗菌药物，合理指导临床用药。18临床意义：192、抗酸染色（acid-faststain）

染色原理：

分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。192、抗酸染色（acid-faststain）染色原理20操作方法：1）初染：滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，出现蒸汽即暂时离开，避免干涸，加热3-5分钟，冷却后用水冲洗。2）脱色：3%盐酸酒精脱色30秒-1分钟；用水冲洗。3）复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。20操作方法：21镜检结果：结核分枝杆菌21镜检结果：结核分枝杆菌22

临床意义：

用于鉴定分枝杆菌属细菌，如结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌。22临床意义：233、荧光染色

原理：

采用荧光素标记的已知抗体与细菌结合，含有该抗体的目的细菌在显微镜下发出荧光，非目的细菌则不发出荧光。233、荧光染色原理：24

临床意义：

主要应用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌、痢疾志贺菌、病毒以及寄生虫等的检测与鉴别。24细菌形态学检查法细菌形态学检查法重点提示不染色标本的形态学检查染色标本的形态学检查革兰染色抗酸染色重点提示不染色标本的形态学检查一、显微镜1.普通光学显微镜（lightmicroscope）光源：可见光2.暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）暗背景，菌体发光用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察3.荧光显微镜（fluorescencemicroscope）光源：100W~200W的高压汞灯一、显微镜1.普通光学显微镜（lightmicroscop一、显微镜4.相差显微镜（phasecontrastmicroscope）检查不染色活细菌的形态及某些内部结构5.电子显微镜（electronmicroscope)光源：电子流透射电镜：观察细菌内部超微结构扫描电镜：对细菌表面结构及附件观察一、显微镜4.相差显微镜（phasecontrastmi二、不染色标本的细菌学检查常用方法压滴法悬滴法用途动力试验：检查细菌有无动力及运动状况制动试验：初步鉴别病原菌；鉴定血清型二、不染色标本的细菌学检查常用方法三、细菌染色标本的检查（一）常用染料1.碱性染料：解离后色基带正电荷，如美蓝、结晶紫、碱性复红等。2.酸性染料：解离后色基带负电荷，如伊红、酸性复红、刚果红等。3.中性染料：碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞氏染料、姬姆萨染料等。三、细菌染色标本的检查（一）常用染料三、细菌染色标本的检查(二)常用染色方法单染色法只用一种染料，如吕氏美蓝。用于观察细菌的形态、大小、排列。复染色法（鉴别染色法）用两种或两种以上不同颜色的染料，以区别细菌的着色性。三、细菌染色标本的检查(二)常用染色方法三、细菌染色标本的检查1.革兰染色（Gramstaining）（1）原理细胞壁学说：两种细菌细胞壁结构不同-G+菌肽聚糖层厚、致密，脂质含量少；G-菌薄而疏松，脂质含量多。等电点学说：G+菌pI2～3；G-菌pI4～5化学学说：G+菌含有核糖核酸镁盐多，G-菌含量少。三、细菌染色标本的检查1.革兰染色（Gramstainin三、细菌染色标本的检查-革兰染色（2）结果细菌分为革兰阳性（G+）菌和革兰阴性（G-）菌紫色为革兰阳性菌，红色为革兰阴性菌三、细菌染色标本的检查-革兰染色（2）结果紫色为革兰阳性菌，革兰染色方法革兰染色方法三、细菌染色标本的检查2.抗酸染色（1）原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多，其中主要成分为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与石炭酸复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用，因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到初步鉴别细菌的目的。（2）结果：抗酸性细菌和非抗酸性细菌三、细菌染色标本的检查2.抗酸染色未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌脱色经复染呈蓝色为非抗酸性细菌未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌3.其他染色方法（1）鞭毛染色（2）荚膜染色3.其他染色方法第三章细菌的分离培养第三章细菌的分离培养39二细菌的培养方法三培养基一细菌的接种方法39二细菌的培养方法三培养基一细菌的接种方法40一、培养基1、概念

将细菌生长繁殖所需的各类营养物质按照一定比例配制而成的营养基质，主要用于分离纯种细菌、传代保存细菌、鉴别细菌、研究细菌的生理生化特性和研制疫苗等。40一、培养基1、概念412、种类1）根据组成分类：①合成培养基：用已知化学成分的物质配制而成。

特点：组成成分精确、重复性好，但价格较昂贵。

用途：适用于实验室研究。②天然培养基：用化学成分尚不清楚或不恒定的天然有机物质制成。（如肉浸汁、蛋白胨）

特点：经济。

用途：适用于大规模培养和生产及实验室。412、种类422）根据物理性状分类①液体培养基：把供细菌生长所需要的成分溶于水中，调适当pH，灭菌后即为液体培养基。②固体培养基：液体培养基中加入1.5％-2％琼脂。③半固体培养基：液体培养基中加入0.2％-0.5％琼脂。422）根据物理性状分类43液体培养基固体培养基43液体培养基固体培养基443）根据用途分类：①基础培养基②营养培养基③鉴别培养基④选择培养基⑤厌氧培养基⑥L型培养基443）根据用途分类：453、基本成分（1）营养成分1）水分：水是细菌生长不可缺少的物质，不仅是细菌细胞的组成成

分，也是良好的溶剂。培养基最好使用蒸馏水。2）蛋白胨：是细菌氮、碳的来源。3）血液和血清：血液中含有多种营养成分，是营养培养基的主要原

料之一，适用于对营养要求高的细菌的培养。453、基本成分464）糖类：通常用糖发酵试验检测细菌的生化性状。5）肉浸膏：用牛或马的肉浸液浓缩而成，是丰富的营养液，适用于多数细菌的培养。6）酵母浸膏：将面包酵母细胞用自融方法破坏、沉淀后进行浓缩、干燥而成。7）鸡卵和卵黄：凝固后可作为固体培养基，如培养结核分枝杆菌的罗氏培养基。8）胆汁和胆盐：可用于制备鉴别培养基和增菌培养基。464）糖类：通常用糖发酵试验检测细菌的生化性状。47（2）凝固剂1）琼脂：主要化学成分是多糖，在98℃以上溶于水，至45℃以下凝固。2）明胶：主要成分是蛋白质，但是营养价值不高，在24℃以上溶解，故不能在37℃孵育。47（2）凝固剂48（3）抑菌剂

抑制杂菌的生长，常用的有胆盐、孔雀绿、亚硫酸钠、苯乙醇等。（4）指示剂

指示剂是为了检测培养基中pH的变化，常用的有酚红、溴甲酚紫、甲基红、酸性复红等。48（3）抑菌剂494、培养基的制备1）调配与溶化：用电子天平称量一定的原料，并加蒸馏水至所配置的体积，若加有琼脂粉，则需加热溶解。2）调整pH：一般培养基的pH为7.2-7.6左右，经高压锅灭菌后其PH可发生0.1-0.2的变动。494、培养基的制备503）过滤澄清：液体或半固体培养基常采用滤纸过滤，固体培养基在融化后趁热用纱布或双层纱布加脱脂棉过滤。4）分装503）过滤澄清：液体或半固体培养基常采用滤纸过滤，固体培养515）灭菌：高压灭菌，103.4kPa，121.3℃，15-30min。6）检测与质控7）保存：注明名称、日期。一般放在4℃冰箱保存，不宜超过一周。515）灭菌：高压灭菌，103.4kPa，121.3℃，15525、细菌常用培养基

血平板、巧克力平板、

中国蓝平板或伊红亚甲蓝平板、

麦康凯平板、SS琼脂、碱性琼脂

或TCBS琼脂、血液增菌培养基、

营养肉汤血培养瓶真菌培养管麦康凯琼脂平板血琼脂平板525、细菌常用培养基血培养瓶真菌培养管麦康凯琼脂平板血琼脂53

二、细菌的接种方法1）平板划线法：分区划线法：含菌量较多的标本（如脓汁等）。连续划线法：含菌量较少的标本。2）斜面接种法：

挑取单个菌落，接种针从斜面底部自下而上划一直线，再从底

部向上做S型划线接种。53二、细菌的接种方法54分区划线法54分区划线法553）倾注平板法：用无菌吸管吸取原标本或经适当稀释的标本1ml，置于无菌平皿内，倾入已融化并冷至50℃左右的培养基，立即混匀待凝固后倒置于35±1℃培养。4）穿刺接种法：由培养基中央刺到距管底约半厘米处，然后沿穿刺线退出接种针。553）倾注平板法：用无菌吸管吸取原标本或经适当稀释的标本15）液体接种法：将试管倾斜30度角，接种环触到试管的内壁研磨数次，然后让试管回复到原来的直立位置淹没接种部位。6）涂布接种法：加定量的菌液于琼脂平板表面，用灭菌L型玻璃棒反复涂布几次，使菌液均匀的分布在琼脂表面。565）液体接种法：将试管倾斜30度角，接种环触到试管的内壁研磨57三、细菌的培养1）需氧培养：指需氧菌或兼性厌氧菌在有氧条件下的培养。2）二氧化碳培养：某些细菌在培养时，特别是初次分离时需要5%-10%的CO2环境。3）微需氧培养：即在5%-6%

O2，6%-10%

CO2的环境生长。4）厌氧培养：细菌对氧敏感，培养过程中需造成无氧环境。57三、细菌的培养58四、细菌的生长性状1）液体培养基：大多数菌呈均匀混浊状态，少数链状的细菌（如链球菌）则呈沉淀生长，专性需氧菌（如分枝结核杆菌）呈表面生长，形成菌膜。58四、细菌的生长性状59

3）固体培养基（1）菌落：单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团，称为菌落。

（2）菌落分为三型：①光滑型（S型菌落）：表面光滑、湿润、边缘整齐。②粗糙型菌落（R型菌落）：表面粗糙，干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘不整齐。③黏液型菌落（M型菌落）：粘稠、有光泽、似水珠样。593）固体培养基602）半固体培养基（1）有鞭毛的细菌，沿穿刺线呈羽毛状或云雾状浑浊生长。（2）无鞭毛的细菌：只能沿穿刺线呈明显的线状生长。602）半固体培养基细菌的培养与分离技术细菌的培养与分离技术重点提示培养基的主要成分及作用培养基的种类培养基制备的基本程序细菌接种与培养方法细菌在培养基中的生长现象重点提示培养基的主要成分及作用一、培养基概念：人工配制的、适合细菌生长繁殖的营养基质。要求：培养基必须含有细菌生长繁殖所需的营养物质和适宜的pH值。一、培养基概念：人工配制的、适合细菌生长繁殖的营养基质。一、培养基（一）培养基的组成1.营养物质：氮源、碳源、无机盐、生长因子蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖（醇）类、血液、鸡蛋和动物血清、无机盐类、生长因子2.水：蒸馏水或去离子水3.凝固物质：即赋形剂，常用琼脂、明胶一、培养基（一）培养基的组成一、培养基4.抑制剂抑制非检出菌的生长或使其少生长，以利于检出菌的生长。胆盐、煌绿、亚硫酸钠、某些染料及抗生素等。5.指示剂常用的指示剂：酚红、中性红、中国蓝、溴甲酚紫、酸性复红等。一、培养基4.抑制剂一、培养基1.按用途分类基础培养基：只有基本营养成分营养培养基：加有血液、血清等鉴别培养基：含有特定底物和指示剂选择培养基：含有抑制剂特殊培养基：厌氧、细菌L型（二）培养基分类一、培养基1.按用途分类（二）培养基分类一、培养基2.按物理性状分类液体培养基：增菌固体培养基：分离培养、纯化、增菌半固体培养基：动力检测、保存菌种一、培养基2.按物理性状分类一、培养基（三）培养基的制备1.调配：根据培养基组成，准确称取各组分，先加一部分蒸馏水，再加培养基干粉，最后补足水量。2.溶解：液体培养基不需加热3.校正pH：一般7.2~7.64.过滤澄清：液体培养基用滤纸；固体培养基用纱布（若培养基澄清，此步可省略）一、培养基（三）培养基的制备一、培养基5.分装平板：灭菌后冷却至50~60℃时倾倒

90mm内径倾注25~30ml（4mm厚）：药敏用

90mm内径倾注13~15ml（3mm厚）：培养用琼脂斜面：分装量为试管的1/4~1/3，灭菌后趁热摆成斜面，斜面长度约为试管的2/3。高层、半固体、液体：分装量为试管长度的1/3。一、培养基5.分装一、培养基6.灭菌高压蒸汽灭菌无糖：103.4kPa121.3℃维持15~20min有糖：68.95kPa115℃维持15min间歇蒸汽灭菌法：血清、牛乳、鸡蛋血清凝固器灭菌一、培养基6.灭菌一、培养基7.质量检验无菌试验：将制好的培养基在35℃孵育过夜，判定是否灭菌合格。效果检查：按不同的培养要求，接种相应菌种，观察细菌的生长状况，判断培养基是否符合要求。8.保存

4℃冰箱保存1周左右一、培养基7.质量检验二、细菌的人工培养（一）无菌技术无菌技术是指防止微生物进入物品或机体，同时防止待检物中可能存在的病原微生物污染周围环境及工作人员的规范化操作技术无菌技术是保证细菌检验质量，防止