肾衰泻浊丸通过调控gf-

肾衰泻浊丸通过调控gf-

慢性肾衰竭（crf）是各种慢性肾疾病发展的最终阶段。肾间质纤维是肾衰竭发展到最终阶段的各种肾疾病的一条共同通道。转化生长因子-β1(TGF-β1)高表达是肾间质纤维化形成的中心环节,Smads蛋白是TGF-β1家族信号从受体到核的细胞内转导分子,TGF-β1/Smads信号通路是肾脏纤维化主要的最终的共同通路。BMP-7是重要的抗肾间质纤维化因子,可通过影响TGF-β1/Smads通路的信号转导、与TGF-β1存在互逆作用等多种途径发挥抗肾纤维化作用。肾衰泻浊丸是著名中医学家张琪教授经过长期临床实践总结的经验方,通过临床观察证实能够显著改善肾功能,延缓CRF的进展。本文通过观察本方对CRF大鼠BMP-7/Smads/TGF-β1信号转导通路的影响,以探讨其对CRF的治疗作用及抗肾间质纤维化的机制。材料和方法1药物、试剂与仪器肾衰泻浊丸由大黄、草果仁、黄连等12味中药组成,50g/瓶,由黑龙江省中医研究院制剂室提供。尿毒清颗粒5g/袋,由广州康臣药业有限公司生产。腺嘌呤50g/瓶,由美国Sigma公司生产。2pcr引物TGF-β1兔抗大鼠多克隆抗体,Smad6兔抗大鼠多克隆抗体,BMP-7兔抗大鼠多克隆抗体,购自武汉博士德公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。TGF-β1上游引物:5′-CTTTAGGAAGGACCTGGGTT-3′,下游引物:5′-CAGGAGCGCACAATCATGTT-3′;β-actin为内参,上游引物:5′-CACGGCATTGTAACCAACTG-3′,下游引物:5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′。3腺点诱导crf大鼠肾组织检测雄性Wister成年大鼠68只,体重200～250g,由沈阳双义啮齿类实验动物中心提供,微生物控制等级:一级。随机取8只正常大鼠作为空白对照组,给予等量蒸馏水灌胃,其余大鼠给予2.5%腺嘌呤混悬液按250mg·kg-1·d-1灌胃,连续给药14d,之后改为125mg·kg-1·d-1,连续给药14d,给药过程中大鼠共死亡8只。第29天,采用眶底静脉丛取血0.8～1ml,测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)值后,随机处死空白对照组大鼠2只,腺嘌呤灌胃大鼠10只,取大鼠肾组织做Masson染色,证实腺嘌呤诱导CRF大鼠模型制作成功。将剩余42只CRF大鼠随机分为5组,其中模型组9只,尿毒清对照组9只,肾衰泻浊丸低剂量组(简称低剂量组)、肾衰泻浊丸中剂量组(简称中剂量组)和肾衰泻浊丸高剂量组(简称高剂量组)各8只。4单次用药剂量d-1,低剂量者实行2/2的灌胃管理模型制作结束后,分别采用肾衰泻浊丸和尿毒清进行治疗。中剂量组为临床等效组,按1.58g·kg-1·d-1灌胃,浓度为15.8%;低剂量组为其1/2,按0.79g·kg-1·d-1灌胃,浓度为7.9%;高剂量组为其2倍,按3.16g·kg-1·d-1灌胃,浓度为31.6%。尿毒清组按1.81g·kg-1·d-1灌胃,浓度为20%。空白对照组、模型组给予同体积蒸馏水灌胃,共治疗60d。5免疫组织表达BUN采用酶法,Scr采用苦味酸法检测;肾脏病理切片做Masson染色于光镜下观察。采用免疫组织化学法检测肾组织中的TGF-β1,Smad6,BMP-7,BMP-7RⅡ的蛋白表达;采用WesternBlot法检测肾组织内的Smad6,BMP-7蛋白的表达,采用半定量RT-PCR检测肾组织内TGF-β1mRNA的表达水平。6实验数据的统计与分析实验结果采用SPSS13.0统计软件分析,实验数据以(x¯±s)(x¯±s)表示,两两比较用q检验,多组间比较用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1治疗后bun治疗过程中,模型组死亡2只,尿毒清组和高剂量组各死亡1只,共死亡4只。治疗后,各治疗组BUN,Scr与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。中剂量组与尿毒清组比较差异有统计学意义(P<0.05)。说明肾衰泻浊丸能够降低大鼠血清BUN、Scr水平,改善肾功能。见表1。2肾病理改变2.1不同剂量各组小鼠肝肾组织病理学检查空白对照组:肾组织无病理改变,肾小球、肾小管无异常,小管管腔无结晶物沉积,肾间质无异常改变。模型组:肾小管萎缩,上皮细胞变性、坏死,可见较多异物肉芽肿形成。棕黄色结晶占据整个肾小管,少部分未被结晶沉积的小管呈代偿性扩张。尿毒清组:肾小管上皮细胞颗粒变性,腔内可见管型形成;肾小管内棕黄色结晶物沉积较多见,结晶物占据整个管腔,肾间质少量炎症细胞浸润。低剂量组:肾小管上皮细胞颗粒变性不明显,小管代偿性扩张,肾小管间质内棕黄色结晶沉积较模型组少见,肾间质少量炎症细胞浸润。中剂量组:肾小管内棕黄色结晶沉积偶见,肾间质极少量炎症细胞浸润。高剂量组:肾小管上皮细胞颗粒变性,腔内可见管型形成;肾小管内棕黄色结晶物沉积较多见,结晶物占据整个管腔,肾间质大量炎症细胞浸润。见图1。2.2各组治疗前后肝肾组织病理学检查正常肾组织染色主要位于基底膜、包曼氏囊、系膜区和肾小管间的毛细血管周围,肾小管未见萎缩,肾间质无炎症细胞浸润及纤维化。模型组肾小管片状萎缩、可见管腔闭塞,肾间质片状炎症细胞浸润,纤维组织片状增生。治疗后各治疗组肾小管间质病变减轻,中剂量组肾小管小灶状萎缩,肾间质极少量炎症细胞浸润,纤维组织增生成小灶性、少量分布。尿毒清组和低剂量组肾小管局灶状萎缩,肾间质少量炎症细胞浸润,纤维组织局灶状增生。高剂量组肾小管多灶状萎缩,肾间质大量炎症细胞浸润,纤维组织多灶状增生。见图2。3smad6、bmp-7的蛋白表达由图3及表3可见,Smad6与BMP-7的蛋白表达趋势一致。各治疗组与模型组相比,Smad6、BMP-7的蛋白表达极显著增多(P<0.01);中剂量组与尿毒清组相比,Smad6、BMP-7的蛋白表达极显著升高(P<0.01)。4肾衰泻浊丸对mtgf-2mrna表达的影响mRNA表达水平的影响由图4及表4可见,治疗后,治疗各组与模型组比较,TGF-β1mRNA表达水平极显著减弱(P<0.01);中剂量组与尿毒清组比较,TGF-β1mRNA表达水平显著减弱(P<0.05),说明肾衰泻浊丸能减少TGF-β1mRNA的表达。电泳强度比较显示:空白对照组<中剂量组<低剂量组<尿毒清组<高剂量组<模型组。抗肾间质纤维化慢性肾衰竭是指所有原发性或继发性慢性肾脏疾患所致的进行性肾功能损害所出现的一系列症状和代谢紊乱组成的临床综合征,是各种慢性肾脏疾病发展的最终阶段。其病理变化是肾脏的纤维化,包括肾小球的硬化和肾间质的纤维化。各种原因引起的慢性肾功能损伤与肾间质纤维化的相关程度,较肾小球病变更为密切,肾间质纤维化是预测肾脏病情的重要指标,对肾病的预后有着重要的影响,抗肾间质纤维化防治CRF的重要地位已取得公认。细胞因子在肾间质纤维化发展过程中起着重要作用,它们通过与靶细胞膜上的受体相结合通过各自的传导通路,将指令传到靶基因产生生物学效应。影响肾间质纤维化的细胞因子可以分为促肾间质纤维化因子如TGF-β1和抗肾间质纤维化因子如BMP-7等。TGF-β是目前已知细胞因子中最重要的调节因子,是受到各种外源性刺激后组织发生纤维化的最关键因子,其中的TGF-β1是众多因子发挥作用的中心环节。TGF-β1及其介导的肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化与肾间质纤维化关系密切。TGF-β1高表达是肾间质纤维化形成的中心环节。Smads蛋白是TGF-β1家族信号从受体到核的细胞内转导分子,是目前所知的唯一受体的胞内激酶底物。Smad6为抑制性Smad,是TGF-β1信号通路负反馈调节因子,可以抑制信号转导。BMP-7不仅是重要的抗肾间质纤维化因子,可通过多种途径发挥抗肾纤维化作用;同时作为TGF-β超家族成员中最大的一族,可通过增加Smad6表达等途径,影响TGF-β1/Smads通路的信号转导,抑制肾纤维化的进展;且与TGF-β1存在互逆作用,可多方面抵消TGF-β1的促肾纤维化作用。在各种肾脏疾病模型中,BMP-7治疗具有维持肾组织结构和功能的重要作用。应用BMP-7治疗糖尿病肾病大鼠,则可部分逆转肾脏肥大,恢复肾小球滤过率,降低蛋白尿,明显改善肾小球病理改变,降低局灶性节段性肾小球硬化。通过输尿管逆向注入含有BMP-7重组腺病毒可使肾间质纤维化大大降低,为抑制肾间质纤维化开辟了一条崭新的途径。BMP-7通过以下途径影响TGF-β1/Smad信号传导:BMP-7与其Ⅱ型受体结合后再与Ⅰ型受体结合,而使Ⅰ型受体发生磷酸化。Ⅰ型受体被磷酸化后,作用于Smad1或Smad5竣基端末端的2个丝氨酸,使之磷酸化,随后Smad1或Smad5再与Smad4结合成复合体,移位到细胞核内,再作用于特定基因的启动子,引起相应生物学效应,如使Smad6表达增加等。体外实验表明,BMP-7在近曲小管上皮细胞中能增加Smad6表达,而Smad6抑制TGF-β1的信号传导,抑制靶基因的转录。BMP-7在近曲小管上皮细胞的抗炎症和细胞保护作用,与上调Smad6表达密切相关。肾衰泻浊丸是根据中晚期CRF湿浊化热,湿热内蕴,郁久成毒的病机特点研制而成。方中大黄为君;臣以黄芩、黄连清热解毒,通腑泻浊;草果仁、藿香、苍术芳香化湿亦为臣药,砂仁、陈皮、紫苏行气健脾祛湿,和胃降逆止呕,助君药泻浊;佐以半夏开痞止呕,干姜防苦寒伤胃。共奏清热解毒,祛湿化浊之功。方中药物大多具有抗血小板聚集,抗血栓形成;扩张血管,改善微循环;降血脂,抗脂质过氧化等作用,能够减轻肾脏的损伤。实验证明,肾衰泻浊丸能明显降低慢性肾衰竭大鼠尿素氮、肌酐水平;改善肾小管-间质病理变化;上调肾组织中Smad6、BMP-7的表达,降低TGF-β1的表达。说明肾衰泻浊丸可以减轻慢性肾衰竭大鼠的肾功能损伤及肾小管及间质损害,推测肾衰泻浊丸可能是通过上调慢性肾衰竭大鼠肾组织中BMP-7、Smad6的表达,下调TGF-β1的表达,从而抑制了TGF-β1信号向细胞核内转导的通路;肾衰泻浊丸通过影响BMP-7/Smads/TGF-β1信号通路的转导而减轻肾间质纤维化可能是其延缓慢性肾衰竭进展的机制之一。本实验中肾衰泻浊丸中剂量组为临床等效剂量组,低剂量组的剂量为其二分之一,高剂量组的剂量为其2倍。实验结果显示中剂量组疗效最好,其次为低剂量组,而高剂量组的治疗效果与模型组比较差异无统计学意义,效果最差。可见肾衰泻浊丸的疗效虽随着用药剂量的减少而减效,但当超过临床合理用量时,并未随着用药剂量的增加而增加。分析其原因,可能与肾衰泻浊丸的作用机制有关。该药主要是通过调整脾胃功能,增加大便次数,软化便质,使大