不同药物降压对肾性高血压大鼠imd基因表达的影响

不同药物降压对肾性高血压大鼠imd基因表达的影响

1imd在高血压心肌组织及病理生理中的作用中介素（imd）是roh和geti发现的相同物质，属于减少钙基因（cacliman）相关的基因（calciman）家族的成员。imd磁共振成像可广泛存在于中枢神经和周围器官。IMDmRNA在异丙肾上腺素诱导的肥厚心肌中表达增加,有报道给自发性高血压大鼠(Spontaneoushypertensiverat,SRH)持续、大剂量地静脉注入IMD,可降低平均动脉压和抑制心肌功能、减轻心肌肥厚,所以人们推测IMD在高血压肥厚心肌细胞中代偿性的升高,并具有降压扩血管作用和改善心肌肥厚的作用。在一氧化氮合酶抑制剂诱导的压力超负荷模型的左室心肌细胞中,IMD及其受体成分(CLR、RAMP1,RAMP2,RAMP3)表达均明显上调,应用肼屈嗪和或氢氯噻嗪使收缩压恢复正常后,CLR、RAMP2,RAMP3的表达恢复正常,但IMD和RAMP1仍然高表达,同时心肌厚度也未恢复正常,说明在此种高血压动物模型中,IMD在高血压心肌肥厚的病理生理过程中发挥重要作用,IMD的作用与心肌压力超负荷无关。但是这未能证明在所有的高血压动物模型中IMD变化规律,本实验旨在研究肾血管性高血压大鼠肥厚心肌中IMD表达的规律,及缬沙坦、氨氯地平和依那普利对此的干预作用。2材料和方法2.1动物高血压的形成选用健康雄性SD大鼠(280～320g,四川省中医药研究所)。实验前至少适应性笼养10d以上,室温21℃,自由饮水和进食。用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30mg·kg-1)。动物取右侧卧位,暴露左肾区,在左肋弓下距离脊柱0.5cm处作一切口,入腹膜后探出左肾,分离左肾动脉,将直径为0.22mm的针灸针放置在左肾动脉上,用手术缝线结扎,抽出针灸针,缝合关闭创口,让大鼠从麻醉状态下苏醒。假性手术组分离左肾动脉,仅用手术缝线绕过,不予结扎,余下操作与以上模型组相同。以术后血压超过140mmHg时即确定动物高血压形成,并用于药物实验。所有动物术后饲养于清洁级动物实验室,自由取食与饮水。2.2尾动脉血压测定采用RBP—III型大鼠血压心率仪(中日友好医院),应用标准尾套法在大鼠清醒状态下测定尾动脉血压。测量前大鼠在预热箱中34℃下预热10～15min。测量时间设置在每天上午8∶00-12∶00,每只至少测定3次,取3次结果的平均值作为血压数值。在术后第1个月每周至少测定血压一次,以后2周测定血压1次。2.3药物干预及给药剂量以收缩压≥140mmHg为标准造模,成功后随机分组成五组:(1)单纯不完全结扎左侧肾动脉(renalarteryconstructiongroup,RAC,n=8);(2)不完全结扎左侧肾动脉+缬沙坦组(Valsartangroup,Val,n=7);(3)不完全结扎左侧肾动脉+氨氯地平组(Amlodipinegroup,Aml,n=7);(4)不完全结扎左侧肾动脉+依那普利组(Enalaprilgroup,Ena,n=8);(5)假性手术组(Shamoperationgroup,So,n=6)。以上药物干预组于术后第5周开始,每周测量动物体重,开始给第2组缬沙坦30mg/(kg·d)),第3组氨氯地平5mg/(kg·d),第4组依那普利20mg/(kg·d),每组均每日给药1次,连续给药10周。各组药物剂量的选择参照文献,此剂量已被证实可降低肾性高血压大鼠的血压,并抑制左室心肌肥厚。以上各组分笼喂养,药物分别溶于蒸馏水中通过胃管灌饲给药。假手术对照组及高血压对照组给予同等容积的溶剂。对那些被不完全结扎但在术后第4周末血压仍未升高的大鼠,将在给药前从药物实验中剔除。在给药时间结束之时,再次测量动物体重和血压。2.4go-dt/dt的制备MMLV逆转录酶及dNTP、Tag酶、Oligo(dT)15primer、扩增的寡核苷酸引物均由上海生工生产,日本产OLYMPUS显微镜;显微镜目镜测微尺系上海第三光学仪器厂产品。2.5心肌细胞横径检测开胸摘取心脏在预冷(0～4℃)的DEPC处理的水中洗去心腔中残血,用滤纸(DEPC处理)将心脏表面水吸干,剪去左右心房及右心室,即所得左心室,计算左心室质量指数(mg/g)=左心室重量/体重。称重后取两份,一份固定在4%多聚甲醛中过夜,行常规石蜡包埋,以用作心肌细胞横径的测量;另一份用于左心室IMDmRNA的测定。2.6心肌细胞横径检测沿冠状面于心脏最大横径处分别切取约3mm厚的左室游离壁心肌,常规制作HE切片。在苏木精(Hatmatoxylin)-伊红(Eosin)染色(HE)切片上,用显微镜目镜测微尺测量左室心肌细胞横径(Leftventriculartransectiondiameter,VTDM)每张切片先在低倍镜下观察左室游离壁,然后高倍镜下(10×40)在心肌纵断面随机选取20个胞浆横纹清晰、胞核完整、形状规则的心肌细胞,应用SPOTVERSION4.6显微图像分析软件测量有核处横径,取其均值为该例的LVTDM。2.7pcr扩增产物的表达心肌组织总RNA提取和IMDmRNA的测定用Trizol一步法提取上述所剩余心肌组织总RNA、MMLV逆转录酶及Oligo(dT)15primer逆转录成单链cDNA。PCR反应体系25μl:cDNA1μl、IMDprimerF0.5μl,IMDprimerR0.5μl,2.5mmol/ldNTP2μl,TagDNA聚合酶0.2单位,2.5mmol/LdTNP1μl,含15mmol/LMgCl2的10×PCR缓冲液2.5μl,反应条件:94℃变性5min,然后94℃30s,55℃30s,热循环30次,72℃40s。取1μlcDNA产物,以β-actin为引物,反应条件为:94℃变性5min,然后94℃30s,55℃30s热循环24次,72℃40s。PCR扩增产物检测(半定量RT-PCR):RT-PCR扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶上经100V恒压电泳30min后,溴乙锭染色后取出该凝胶,在凝胶分析系统上拍照,定量扫描仪分别获得376bp和446bp条带,分析各样本扩增条带的光密度值,将各目的基因扩增条带的光密度数据分别与β-actin基因的光密度数据相比得出各样本的光密度相对比值,即为IMDmRNA的相对含量。IMDmRNAPCR反应条件(见表1)。2.8b分析结果采用SPSS13.0统计软件(SPSSforWindows13.0)对所得数据进行分析,各组数值以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示。组间比较采用单因素方差(One-wayANOVA)分析,Student-Newman-Keuls(SNK)方法检验,P<0.05为差异有显著性。3结果3.1心率变化情况取样前Val组、Aml组和Ena组体重较RAC组明显升高(P<0.05),并较So组明显降低(P<0.05)。心率各组无差异(P=0.110),取样前与结扎前无差异。各组结扎前血压无差异,取样前单纯结扎组收缩压较结扎前明显升高,用药组收缩压较单纯结扎组明显减低,但较假手术组仍明显升高,三个用药组组间血压无统计学差异(见表2)。3.2各组心肌细胞横径的比较心肌细胞横径(LVTDM)的变化显示RAC较其它4组心肌细胞横径显著增大,Ena组、Val组和Aml组组间无差异且显著高于So组(见图1和表3)。3.3各组大鼠心肌横径的比较图2纵坐标显示IMDmRNA电泳的条带与β-action光密度比值测定所得数值,横坐标显示不同组别。左心室IMDmRNA在单纯结扎组较对照组和三个药物干预组均显著性升高(P<0.01),三个药物干预组之间两两比较无差异(P=0.810),三者又均较对照组显著性升高(P<0.01)(见图2、表3)。表3说明左心室心肌横径在单纯不完全结扎组(RAC)均较其它各组有显著性增加(P<0.01),Val组、Aml和Ena组组间无差异(P=0.622),且显著高于So组(P<0.05)。左心室质量指数在单纯不完全结扎组(RAC)均较其它各组有显著性增加(P<0.01),Val组、Aml和Ena组间无显著性差异(P=0.263),So组较Val组、Aml和Ena组显著性降低(P<0.05)。3.4mdmrna泳带第一列为DNAMarker,其后五列上排为标准β-actin泳带,下排为左心室肌IMDmRNA泳带。显示左心室IMDmRNA在So组较其它组显著性升高(P<0.01),Val组、Ena组和Aml组均较对照组显著性升高(P<0.01),Val组、Ena组和Aml组之间无差异(P=0.767),So组的电泳条带几乎不显像(见图3)。4肾性高血压大鼠心肌imd的变化IMD是2003年Roh等发现的一种CGRP家族中的多肽,在血管、左心室甚至在心房、右心室和血清均有低水平的表达,具有降压、扩血管、心脏保护等作用。已有人用RT-PCR半定量的方法在新生心肌和异丙肾诱导的肥大心肌细胞中测到了IMDmRNA,而正常心肌细胞中无表达;又有人持续、大剂量地给离体自发性高血压大鼠(SRH)静脉注入IMD,可降低平均动脉压和抑制心肌功能、减轻心肌肥厚,这说明IMD是一个新发现的对心肌肥厚起代偿性保护机制的内生性因子。袁鹰等发现,SHR心肌和主动脉的IMDmRNA水平上调。还首次用放射免疫(RIA)法测定发现IMD在自发性高血压大鼠(SHR)时血浆、心肌和主动脉中的含量升高。但是SHR组大鼠组的血浆中的IMD含量和收缩压呈显著负相关,对照组WistarKyoto(WKY)大鼠组则呈显著正相关。这说明机体在正常生理状态下,血压是受血浆IMD水平调控的,这是一种代偿性增高。而在高血压状态下,由于调节通路的障碍及机体的某种器官损伤导致了这种代偿性反应处于失衡状态,从而导致了IMD出现了绝对或相对不足,且伴随着血压的升高和病理损伤过程的加重,使得这种失代偿状态更加严重,从而出现了血压越高,而IMD血浆含量越低的负相关。为了解肾性高血压大鼠IMD的变化规律,本实验中应用肾动脉结扎造肾性高血压模型,用左心室游离壁心肌横径和心肌质量指数来衡量左心室肌肥厚,发现单纯结扎组大鼠心肌横径和心肌质量指数较其他组显著增加,表明肾性高血压大鼠心肌肥厚模型建立成功。实验发现三种降压药物组可以相似地减轻心肌肥厚,左心室IMDmRNA在单纯结扎组较其他组显著性升高,三个药物干预组较单纯结扎组降低且组间无差异,由于选用的三种药物从不同机理降压,其中缬沙坦为ARB(血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂),由于抑制了血管紧张素Ⅱ-1受体(AT-1)反馈性地升高血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ),并降低左心室醛固酮(Aldosterone,ALD)水平;依那普利为血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin-convertingenzymeinhibitor,ACEI),抑制了肾素血管紧张素转化酶,使AngⅡ产生减少,也降低左心室ALD水平;氨氯地平作为钙拮抗剂是扩血管剂,对RAAS的影响很小。可见心肌中IMDmRNA的变化与血压或左心室肌肥厚有关,而与干预RAAS的不同环节无关,即心肌IMDmRNA的变化独立于RAAS的变化。本实验为首次发现肾性高血压大鼠(包括单纯结扎组和药物干预组)肥厚心肌中IMDmRNA系统上调,IMD的上调可能参与了肾性高血压大鼠左心室肥大的病理生理过程,药物干预组缬沙坦、氨氯地平和依那普利都可以使上调的IMDmRNA部分恢复,由于同时使高血压和心肌厚度得到相似的改善,即三组比较无差异,所以IMDmRNA的变化是由于三组药物降低了血压还是改善了心肌肥厚还不清楚。Bell等也发现肥厚心肌中IMD上调,且血压降至正常后恢复正常。他们给一氧化氮合酶抑制剂诱导的高血压、心肌缺血大鼠应用阿替洛尔或硝苯地平,使血压降至正常,同时可使NO缺乏的心肌细胞中上调的AM、IMD及二者的受体成分恢复正常,说明压力负荷和缺血都参与了刺激心肌肥厚,并诱导了这些相关调节肽及受体的上调。但另有研究却有相反的结论:IMD的作用与心肌压力超负荷无关。Bell和Zhao又在另一个一氧化氮合酶抑制剂诱导的压力超负荷模型的左室心肌细胞中发现,IMD及其受体成分表达均明显上调,应用肼屈嗪和或氢氯噻嗪使收缩压恢复正常后,但IMD仍然高表达,同时心肌厚度也未恢复正常,与本研究不同点是利尿剂不能完全逆转压力超负荷模型的左室心肌细胞的心肌肥厚,并且也不能下调左室心肌细胞中IMD,即IMD的上调不因高血压降低而恢复