肾康丸对糖尿病肾病大鼠氧自由基代谢的影响

肾康丸对糖尿病肾病大鼠氧自由基代谢的影响

糖尿病性肾炎（dn）发病率高，发病率机制不明确，治疗复杂，疗效差，危害巨大。目前认为氧化应激(OS)是DN发病的重要机制,在糖尿病(DM)的慢性并发症中可能起主要作用。笔者自主开发研制的中药新药肾康丸(国家发明专利号200610036515.2)用于治疗DN已长达9年余,疗效确切;动物实验研究也表明肾康丸可使DN大鼠24h尿蛋白定量显著减少、肾脏病理改变明显减轻。本研究旨在通过观察肾康丸对DN大鼠氧自由基(OFR)代谢的影响,探讨其肾保护作用的机制。1材料和机器1.1实验动物雄性SD大鼠56只,体质量180～230g,购自中山大学实验动物中心。1.2大鼠尿微量血药浓度、超氧化物歧化酶及trizel肾康丸(由黄芪、水蛭、金樱子、益母草、玉米须、芡实组成),南方医科大学珠江医院药剂科生产,制剂号20031214;厄贝沙坦片(安博维),杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产,批号(2000)J-24;链脲佐菌素(STZ,Sigma);酶联免疫吸附测试大鼠尿微量白蛋白试剂盒(ADL)、过氧化氢酶(CAT)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)试剂盒,南京建成生物工程研究所Trizol(Invitrogen公司,USA);逆转录RevertraAce(ToYoBo公司,中国上海);PCRTaqdNTPs(鼎国生物);100～600bpmarker(Tiangen公司),PCR引物(上海生物工程技术服务有限公司)。1.3仪器、检测和分析方法752型分光光度计(上海医用设备仪器厂);电热恒温水浴箱(Grant公司,USA);万分之一分析天平(上海天平仪器厂);Ultrospec2000型核酸分析仪(Pharmacia公司,England);GeneAmpPCRSystem9700扩增仪(PE公司,USA);凝胶成像分析系统(UVI公司,England);UNIVERSAL32R台式低温离心机(Hettich公司,Germany);2K15高速离心机(Sigma公司,USA);Wallac1420多标记分析系统(VICTOR公司,芬兰)。2方法2.1大鼠dn模型建立所有动物适应性喂养1w后,禁食12h,空腹状态下、STZ按55mg/kg一次性腹腔注射,STZ临用前用枸橼酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH4.5)配制。另设正常对照组(n=8),注射等量枸橼酸钠缓冲液。全部大鼠标准饮食喂养,不使用胰岛素及其他降糖药物。72h后开始监测空腹血糖、尿糖、尿量、24h尿微量白蛋白排泄率的变化,若连续3次达到下列标准者,即认为DN模型建立:(1)空腹血糖>16.6mmol/L;(2)尿糖强阳性;(3)尿量>原尿量150%;(4)24h尿微量白蛋白排泄率>30mg/24h。大鼠造模成功后,随机分为4组(n=12):DN模型对照组、肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组。肾康丸、厄贝沙坦分别按3000、50mg/(kg·d)每日分2次灌服,按照人与大鼠体表面积换算,分别相当于成人300、5mg/(kg·d),连续8w。正常对照组与模型组灌服等体积生理盐水。2.2大鼠的量体质量实验结束前1天代谢笼收集24h尿液,计24h尿量。大鼠处死前称量体质量。以0.3%戊巴比妥钠按35mg/kg体质量的剂量腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,分离血清,-20℃保存;取双侧肾脏,称量质量后液氮冻藏。2.324h尿微白测定按照试剂盒说明书,采用酶联免疫吸附法检测。2.4低温离心离心测定取肾皮质0.5g,冰浴条件用冰冷生理盐水制成10%的匀浆液,低温离心机离心,取上清液。MDA含量采用硫代巴比妥酸反应法、GSH-Px活性采用DTNB比色法;CAT活性采用紫外速率测定法、Cu,Zn-SOD活性采用联苯三酚自氧化法,严格按照试剂盒说明书操作。2.5肾组织中rna的表达及pcr检测(1)PCR引物:由上海生物工程技术服务有限公司合成。GSH-Px:反义链5′-CCACCACCGGGTCGGACATAC-3′,正义链5′-CTCTCCGCGGTGGCACAGT-3′,引物长度为290bp;CAT:反义链5′-TGGGTTTCTCTTCTGGCTATGG-3′,正义链5′-ACGAGATGGCACACTTTGACAG-3′,引物长度为341bp;Cu,Zn-SOD:反义链5′-GTCCCCATATTGATGGAC-3′,正义链5′-GTTCCGAGGCCGCCGCGCGT-3′,引物长度为192bp;β-actin:反义链5′-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3′,正义链5′-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3′,引物长度为327bp。(2)总RNA提取:每组随机选取8只大鼠的肾组织按Trizol试剂说明书提取,用核酸分析仪进行定量,D(λ)260/280判断其纯度,根据测定结果用去RNA酶水将各组样品RNA浓度调为一致,-70℃保存。(3)逆转录(RT):反应液组成:RNaseFreeH2O9μL,5×RTBuffer4μL,dNTPMixture(10mmol/Leach)2μL,Super-RI0.5μL,RT-Enhancer0.5μL,序列特异的下游引物(10pmol/μL)1μL,ReverTraAce1μL,总RNA2μL。42℃反应50min。(4)PCR扩增:取逆转录产物5μL,加入:RNaseFreeH2O32.5μL,dNTPMixture(2mmol/Leach)5μL,10×PCRBuffer5μL,序列特异的上游引物(10pmol/μL)1μL,序列特异的下游引物(10pmol/μL)1μL,DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL。PCR热循环参数为:94℃变性3min,然后94℃50sec,56℃40sec,72℃1min,循环35次,终末延伸72℃7min。(5)电泳及半定量分析:取PCR产物10μL,与1μL上样缓冲液混合,2%琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)电泳。电泳后凝胶在紫外灯下观察、拍照,以β-actin为内参照,用凝胶成像分析系统进行半定量分析,以GSH-Px、Cu,Zn-SOD或CATmRNA与β-actinmRNA光密度比值表示GSH-Px、Cu,Zn-SOD或CATmRNA的量。2.6统计学处理数据以x¯±sx¯±s表示。应用SPSS13.0统计软件,治疗后多组间比较采用OneWayANOVE、SNK检验。检验水平α=0.05。3结果3.1各组大鼠肾组织mda含量比较与正常对照组比较,模型组大鼠肾组织MDA含量显著升高。与模型组比较,3个治疗组大鼠肾组织MDA含量均显著降低。与肾康丸组比较,厄贝沙坦组肾组织MDA含量无显著性差异,合用组肾组织MDA含量显著降低(图1)。3.2肾组织gsh-px、cat、cu,zn-sod活性检测与正常对照组比较,模型组大鼠肾组织GSH-Px、CAT与Cu,Zn-SOD活性均显著降低。与模型组比较,3个治疗组大鼠肾组织GSH-Px、CAT与Cu,Zn-SOD活性均显著升高。与肾康丸组比较,厄贝沙坦组肾组织GSH-Px、CAT与Cu,Zn-SOD活性均无显著性差异,合用组大鼠肾组织GSH-Px、CAT与Cu,Zn-SOD活性均显著升高(图2、3)。3.3肾组织gsh-px、cu,zn-sod及cat表达水平比较与正常对照组比较,模型组大鼠肾组织GSH-Px与Cu,Zn-SOD表达水平均显著升高,CAT表达水平无显著性差异。与模型组比较,3个治疗组大鼠肾组织GSH-Px与Cu,Zn-SOD表达水平均显著降低,CAT表达水平无显著性差异。与肾康丸组比较,厄贝沙坦组大鼠肾组织GSH-Px、CAT与Cu,Zn-SOD表达水平均无显著性差异;合用组大鼠肾组织GSH-Px与Cu,Zn-SOD活性均显著降低,CAT表达水平无显著性差异(图4～7)。4肾康丸对dn大鼠肾组织中cu,gsh-px、cat活性的影响Brownlee提出的DM并发症的统一机制学说认为,高血糖通过多元醇、蛋白激酶C、晚期糖基化终产物(AGEs)和己糖胺导致DN等DM微血管病变并发症的4种途径均可能系在高血糖环境下,活性氧(ROS)生成过多导致组织细胞中发生氧化应激的结果。关于抗氧化酶系统(主要包括Cu,Zn-SOD、CAT和GSH-Px)的活性在DM肾组织中变化的研究较多,但至今尚无统一结论。有研究报道在DM大鼠成模3w时,肾组织内SOD及GSH-Px活性较对照组显著升高,而CAT活性与对照组比较无统计学差异。目前比较倾向的看法是:在DM早期,肾组织内部分抗氧化酶的活性代偿性增高,而随着DM病程的延长,其活性逐渐下降,最终导致了肾组织内OS的发生。本实验中笔者也发现,与对照组比较,DN模型组大鼠肾组织中脂质过氧化产物MDA含量显著增加,抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性显著降低,表明DN大鼠体内ROS增多,机体清除ROS的能力下降,OS明显增高。SOD和GSH-Px、CAT的主要作用分别是清除超氧阴离子(O-·2)和过氧化氢(H2O2)。在本实验中,DN模型组大鼠肾组织中Cu,Zn-SOD、GSH-Px、CAT活性下降并不是肾组织中的(O-·2)和H2O2生成减少,更可能的原因是由于OS产物对酶活性的抑制作用和酶活性基团的糖基化所引起。肾组织中Cu,Zn-SOD、GSH-PxmRNA表达水平升高,但其酶的活性反而下降,说明由于DM引起的OS异常,反馈性地升高Cu,Zn-SOD、GSH-PxmRNA的表达水平,因而其酶活性下降更可能的原因是酶蛋白活性基团受抑。DN模型组大鼠肾组织中CAT活性下降而其mRNA表达水平却与正常对照组无显著性差异,可能是由于肾组织中CAT的表达甚少所致。由此可见,DM时不断升高的血糖促进ROS的产生,加重酶活性基团的糖基化,抑制抗氧化酶的活性,而抗氧化酶的活性下降又加重了ROS的生成,形成恶性循环。DN时活性增高的血管紧张素(Ang)Ⅱ诱发了OS的发生,而ROS不但作为AngⅡ的信号分子执行了其细胞毒性作用,并且参与了高糖诱导的肾脏局部AngⅡ的上调。Barnett等观察了Ang转化酶抑制剂(ACEI)和AngⅡ受体拮抗剂(ARB)对DM大鼠肾组织内OS的影响,发现ACEI和ARB均减轻了肾组织脂质过氧化反应,而上调了酶性抗氧化分子的活性,证实了ACEI和ARB的抗氧化作用。本实验中笔者也发现,应用ARB制剂厄贝沙坦干预后,DN大鼠肾组织中MDA含量显著减少,抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性显著增高,SOD、GSH-PxmRNA表达水平下降,表明厄贝沙坦可减少ROS的生成,抑制机体的OS反应。本实验中笔者发现,应用肾康丸干预后,DN大鼠肾组织中MDA含量显著减少、抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性显著增高,SOD、GSH-PxmRNA表达水平下降,与厄贝沙坦组比较均无显著性差异,表明肾康丸减少DN时ROS的生成、抑制OS的作用与ARB制剂厄贝沙坦大致相当。而与肾康丸组、厄贝沙坦组比较,肾康丸和厄贝沙坦合用组上述指标均有显著性差异,表明肾康丸与厄贝沙坦对DN大鼠的OS具有协同抑制作用。肾康丸减少DN时ROS生成、抑制OS作用的可能机制包括:(1)现代药理学研究已证实,肾康丸组方中的黄芪、金樱子、水蛭、玉米须、益母草等均可通过降低脂质过氧化物含量、提高抗氧化酶活性而减轻ROS对机体的损伤,具有一定的抗OS作用。(2)肾康丸组方中的黄芪、金樱子、水蛭、玉米须均具有一定的降糖作用,不但可减少DN时因葡萄糖自身氧化作用增加而产生的大量ROS,而且还可通过抑制高糖诱导的肾脏局