缺氧诱导因子1在肾间质纤维化中的表达及意义

缺氧诱导因子1在肾间质纤维化中的表达及意义

根据最近的研究，缺损可能是慢性肾衰竭的一个共同机制。许多慢性肾脏病的动物模型中均已发现存在明显的肾内缺氧。因此,英国学者Fine提出了进行性肾损害的可能机制——“慢性缺氧学说”。该学说提出,肾小管间质部分的慢性氧缺失是促进肾脏疾病进展和纤维化的重要原因,体外实验证明缺氧可刺激肾小管上皮细胞和间质成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转分化,参与肾间质纤维化的发生发展,缺氧主要通过缺氧诱导因子1α(hypoxia-induciblefactor1α,HIF-1α)发挥作用。本研究旨在通过动物实验探讨HIF-1α在慢性肾间质纤维化中的作用及六味地黄丸对其表达的影响。材料和方法1材料表面1.1动物SPF级雄性SD大鼠30只,体重180～200g,由湖南中医药大学实验动物中心提供并饲养于湖南中医药大学SPF级动物房。1.2湖南科技第一附属医院六味地黄丸(熟地黄24g,山药12g,山茱萸12g,泽泻9g,茯苓9g,牡丹皮9g)购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科。先将药材用相当于药材5倍的自来水浸泡2h煮沸后再微火煎熬30min,过滤后收集煎液,原药渣加少量水煎煮,取二煎液。将两煎液混合,于水浴恒温器上浓缩为每毫升药液含生药1g。1.3试验动物及试剂一抗为兔抗大鼠HIF-1α、PAI-1和TIMP-1多克隆抗体,美国SantaCruz;兔二步法免疫组化检测试剂盒(PV-6001)、二抗为山羊抗兔,北京中杉金桥;DAB显色试剂盒,武汉博士德;ECL化学发光试剂,美国Pierce。2方法2.1肾损害内固定SD大鼠适应性喂养1周后随机分为假手术组、模型组、六味地黄丸组,每组各10只。模型组、六味地黄丸组均在无菌条件下进行5/6肾切除术,以10%水合氯醛麻醉大鼠0.3ml/100g腹腔注射麻醉动物,常规消毒铺巾,从左腹部切口,打开腹腔,静脉夹夹住肾蒂后切除左肾上下极(切除2/3),以明胶海绵压迫止血,复位肾脏。1周后进行第2次手术,切除右侧肾脏。假手术组采取同样步骤,打开腹腔暴露肾脏后避免牵拉肾脏,不切除肾脏。右肾摘除术后第2天,六味地黄丸组予以六味地黄丸灌胃(生药含量按公式:人的剂量×0.018×5/kg体重计算),每天1次,至处死为止;模型组、假手术组以等容积蒸馏水灌胃,给药8周后全部处死。2.2肾组织病理学检测各组大鼠分别于第8周处死,以10%水合氯醛麻醉大鼠0.3ml/100g腹腔注射麻醉动物,常规消毒铺巾,打开腹腔,结扎后摘取肾脏。肾组织分为两部分处理:(1)光镜观察:标本用4%多聚甲醛固定、4℃保存,按常规脱水、透明、包埋,石蜡切片3～4μm,分别进行HE染色、Masson染色及HIF-1α、PAI-1和TIMP-1免疫组化检测。(2)肾组织取出后立即放入液氮罐中,随后转入-80℃冰箱保存待用。2.3肾组织病理学检测肾组织经4%多聚甲醛固定过夜,梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(厚度为3～4μm)后,常规HE染色及Masson染色分析,Olympus显微镜观察肾组织病理变化并拍照。2.4免疫二抗鼠抗体pai-1和timp-1免疫组化PV二步法染色,一抗用兔抗大鼠HIF-1α、PAI-1和TIMP-1抗体,二抗用相应羊抗鼠抗体(工作浓度按产品说明书配制为1∶100或1∶200),染色呈棕褐色或棕黄色者为阳性染色。2.5数码医学分析Olympus显微镜观察肾组织病理变化并拍照,每张切片随机选取5个视野,用麦克奥迪数码医学分析系统(MoticMed6.0)进行图像分析。观察视野内免疫阳性部分的平均灰度值,半定量法评估,组织细胞平均灰度值愈小,蛋白表达愈高。2.6ecl试剂x线显色法常规提取蛋白质样品,BCA法进行蛋白质定量。每泳道50μg蛋白,10%SDS电泳分离后湿转至PVDF膜,封闭,加一抗杂交,4℃孵育过夜,洗膜。加相应二抗室温孵育,ECL试剂X线底片上显色。扫描测定条带灰度值,以与β-actin的比值作为表达强度。3统计学分析计量资料用(x¯±s)(x¯±s)表示,统计学分析采用SPSS18.0统计软件。组间差异比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1肾组织光度检查1.1肾组织病理学检测假手术组大鼠肾组织未见明显病变,肾小球和肾小管大小、形态正常,结构清晰,间质未见明显炎细胞浸润;模型组肾皮质变薄,肾小球系膜细胞明显增生,硬化增多,部分肾小管明显萎缩、消失,部分肾小球发生代偿性肥大,肾小管发生代偿性扩张,可见蛋白管型,肾间质纤维化明显,大量淋巴细胞浸润。与模型组相比,六味地黄丸组病理变化明显减轻,炎细胞浸润减少,肾小管萎缩及间质纤维化程度减轻。见图1。1.2肾间质胶原纤维模型组见图1假手术组肾小球及肾小管仅基底膜染成蓝色,肾间质无明显胶原纤维;模型组肾间质见大量染成蓝色的胶原纤维;六味地黄丸组肾间质可见少量胶原纤维。见图2。2肾组织免疫组化检测2.1肾皮髓质中hoe-1的表达假手术组HIF-1α微量表达,主要在肾皮髓质交界处,模型组和六味地黄丸组肾小管、间质中HIF-1α均表达增加,而肾小球少有表达。见图3。2.2各组pai-1表达情况PAI-1主要在肾小管表达,尤以近曲小管刷状缘明显,肾小球、间质少有表达,假手术组最弱,模型组最强,六味地黄丸组PAI-1表达较模型组明显降低。见图4。2.3timp-1表达TIMP-1主要在肾小管、肾间质表达,尤以近曲小管明显,而肾小球少有表达,假手术组最弱,模型组最强,六味地黄丸组TIMP-1表达较模型组明显降低。见图5。2.4各组大鼠c组,模型组和六味地黄丸组pb肾组织HIF-1α、PAI-1和TIMP-1表达均以模型组最强,六味地黄丸组次之,假手术组最弱,且模型组和六味地黄丸组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。3两组患者中机制地黄丸组对两组实证表1表达持续抬高与假手术组比较,模型组和六味地黄丸组HIF-1α表达持续上调,且模型组高于六味地黄丸组,两者差异有统计学意义(P<0.01)。见图6。肾间质纤维化缺氧诱导因子1(hypoxiainduciblefactor-1,HIF-1)是1992年Semenza等在低氧诱导的肝细胞癌细胞株Hep3B细胞核提取物中发现的一种蛋白质,是迄今为止发现的惟一一个在缺氧状态下发挥活性的特异性转录因子。大量研究表明,缺氧激活的转录因子HIF-1α在纤维化发展中起至关重要的作用,慢性肾衰竭(chronicrenalfailure,CRF)是各种肾脏疾病持续进展的最终结局,其主要病理学特征为慢性肾脏纤维化。慢性缺氧可诱发HIF-1α持续表达,后者上调一系列促纤维化靶基因表达导致肾脏纤维化。因此,慢性缺氧是引起肾小管间质纤维化的一个关键因素,HIF-1α是导致肾间质纤维化的关键因子。5/6肾切除大鼠是目前研究慢性肾脏病进展的理想动物模型。目前已有研究表明:5/6肾切除的大鼠肾脏组织中存在小动脉病变,这种小动脉病变可导致肾小球后毛细血管血流减少和小管间质缺血,而缺血就意味着低氧。Manotham等研究证实,在5/6肾切除的大鼠模型中,在发生小管纤维化前,肾小管已存在明显的缺氧。Zhang等研究5/6肾切除大鼠模型同样证实,管周毛细血管丢失和肾小管间质缺氧在肾间质纤维化不明显之前的早期阶段(术后第3周)已经很严重,并且持续存在于肾间质纤维化的发展过程中。Zeng等应用5/6肾切除大鼠模型探讨缺氧有关的肾纤维化,发现HIF-1α在5/6肾切除大鼠肾组织中显著升高,这一结果证实慢性缺氧存在于5/6肾切除模型。俞小芳等研究5/6肾切除大鼠亦发现在早期阶段(术后第1周末),HIF-1α在肾内表达即开始增加,在术后12周仍有持续表达。本研究显示:5/6肾切除的大鼠模型中,模型组HIF-1α的表达较假手术组明显升高(P<0.01)。Kimura等通过应用5/6肾切除的基因敲除小鼠模型证实了HIF-1α在肾纤维化中的作用,认为抑制HIF-1α的表达是治疗肾脏纤维化的靶点。正常的情况下,细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的生成和降解保持动态平衡。肾脏局部缺血、缺氧及炎症细胞浸润时,纤溶酶原激活物/纤溶酶原激活物抑制物(PAs/PAIs)和基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶抑制物(MMPs/TIMPs)的表达失衡,致使ECM合成增多,降解减少,使大量ECM沉积于肾间质,形成纤维化。因此,PAI-1和TIMP-1表达升高均可造成ECM的降解减少,从而导致ECM的积聚,这是引起肾间质纤维化的重要原因,已有实验证明,HIF-1α可上调PAI-1和TIMP-1的表达。六味地黄丸始见于宋·钱乙的《小儿药证直诀·卷下诸方》,以张仲景《金匮要略》的肾气丸减桂枝、附子,易干地黄为熟地黄而成。六味地黄丸是临床上治疗肾阴虚证型慢性肾小球肾炎的有效方剂,其临床运用广泛,且疗效肯定,然其作用机制尚不明了,前期研究已证实:5/6肾切除大鼠在手术后8周,留存肾不可避免地发生了间质纤维化;给5/6肾切除大鼠灌胃六味地黄丸8周后,其血清尿素氮、肌酐的水平明显低于模型组,并能减少留存肾系膜细胞的增生及间质纤维化,使肾切除大鼠生存期延长。六味地黄丸具有改善5/6肾切除大鼠残肾肾功能的作用,其改善残肾肾功能的作用与六味地黄丸提高肾小球的体积密切相关。在本研究