植物产生菌单宁降解菌的筛选及降解研究

植物产生菌单宁降解菌的筛选及降解研究

这是植物的二次代谢产物，相对分子量为5003000da。这是一种亲水结合的苯酚。单宁的化学性质活泼，饲料中的单宁易与蛋白质结合，使其具有抗营养作用；单宁抑菌作用的存在，也会限制食草动物对营养物质的利用。采用生物降解的方法，开展了对植物单宁生物降解的研究，通过单宁降解菌的作用，将分子量较大的单宁降解为小分子化合物，从而降低或消除单宁的抗营养作用。本项目通过对单宁降解菌的筛选，并研究液体发酵对单宁降解的影响，以期获得具有单宁降解能力的微生物菌株。1材料和方法1.1调查采集、分级从高粱田土壤中采集样品5份，若田块面积小于50m2则按对角线三点采样，若田块面积大于50m2按对角线五点采样。采样一般定点于耕作层10～30cm处土样，先除去表土5～6cm，采集10～25g。以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。霉变葡萄样品2份。1.2固体培养基的制备察氏培养基：NaNO33.0g/l、K2HPO41.0g/l、KCl0.5g/l、MgSO40.5g/l、FeSO40.01g/l、蔗糖30g/l,121℃灭菌20min。制作无糖培养基时，去掉其中的蔗糖组分；制作固体培养基时，加入20g/l的琼脂。发酵培养基：在无糖察氏液体培养基中加入0.5%的水解单宁（国药集团化学试剂有限公司生产），用于降解率的测定。1.3无糖察氏固体培养基的纯化用无菌去离子水将所取样品梯度稀释后，取适当稀释度样品在察氏固体培养基中划线分离，取单菌落进一步在培养基中纯化。取已纯化的单菌落在含0.2%、0.4%、0.5%水解单宁的无糖察氏固体培养基中逐级划线培养。在28℃培养箱中振荡培养72h，观察菌落生长情况。1.4以czn-10cemdau2004为中心的纯化反应采用络合法测定单宁含量。量取30ml培养液[液温(20±1）℃]移入500ml烧杯中，加水至约300ml，置（35±2）℃水浴中预热，精确量取1mol/l乙酸锌溶液20ml置于500ml容量瓶中，加入14ml氨水，摇匀使白色沉淀溶解，缓慢移入上述溶液，边移入边振荡，移毕继续振摇1min后置于原水浴保温30min（间歇振摇数次），待反应完毕，定容。取反应溶液于离心机上以3000r/min离心5min，再取上层清液于离心机上以3500r/min离心10min后，精确量取50ml上层清液，加300ml蒸馏水、25ml氯化铵-氨水缓冲液（pH值10）和1ml铬黑T指示剂，以0.05mol/l乙二胺四乙酸二钠滴定至溶液由酒红色变为暗蓝色，并用空白校正。1ml乙酸锌（溶液浓度1mol/l）消耗单宁0.1446g。络合法测定单宁的含量按下式计算：单宁含量(%)=(20×CZn-10×CEDTA×V)×0.1446式中：CZn——指乙酸锌标准溶液物质的量浓度（mol/l）;通过发酵前后单宁量的变化，计算降解率。1.5处理数据采用SPSS13.0软件进行数据分析，采用origin6.0软件制图。2菌株筛选和发酵由于样品采集来源广泛，其中含有多种细菌和真菌，在降解单宁的微生物中，前人研究的报道中真菌占很大部分，如黑曲霉、镰孢霉属、青霉等。因此，本研究在所有筛选培养基中加入0.1%的氯霉素，来抑制细菌的生长，主要筛选具有单宁降解能力的各种真菌。土壤中含有大量的微生物，经梯度稀释后划线分离，根据生长情况，在察氏培养基中选出20株代表性菌株，从霉变葡萄样品中初筛出15株代表性菌株，进行下面的试验研究。采用单宁为唯一碳源的培养基上逐级划线分离发现，来自高粱土壤样品的20株菌不能生长或生长状况较差。来自霉变葡萄的15株菌，在含0.5%的单宁无糖察氏固体培养基中分离后发现，有3株单菌落能够正常生长，察氏培养基能选择性培养青霉菌和曲霉菌，通过表型观察，所分离出的3株菌中有2株外观全部是青色，命名为SL-2和SL-4,1株黑色曲霉，命名为SL-5。对2株青色霉菌培养时发现，SL-4长出的菌体为球状，大小一致，均匀分散在培养基中，而SL-2生长的菌体大部分粘附在瓶壁上，相互连在一起，因此初步判断，SL-2和SL-4不是同一种菌。三种菌均有待于进一步进行菌种鉴定。采用发酵培养基进行液体发酵，在28℃条件下振荡培养72h，三株菌对单宁的降解率分别达到58.6%、63.9%和49.4%，如图1所示。本研究重点是筛选单宁降解菌，下一步拟研究发酵温度、时间、底物碳氮比等条件，提高单宁的降解率。另一方面，微生物在发酵过程中，在发挥降解作用时不应该产生毒害性物质，才能够在生产中使用，因此，本研究中得到的三株菌也需要开展这方面的研究，例如将菌培养物、发酵产物进行试验鼠的急性毒性试验等。3培养条件优化分离出了3株具有单宁降解能力的菌株，采用发酵培养基，在28℃条件下连