第八章 核移植技术与动物克隆

第八章核移植与动物克隆克隆核移植正确看待克隆关于克隆人克隆：用无性方式产生后代群体。是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体技术水平：分子克隆(molecularclone)：即DNA克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增,提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。重组、建造的DNA分子只有纯化繁殖才有意义。纯化繁殖DNA就称为DNA克隆或分子克隆.基因的纯化繁殖就称为基因克隆。

细胞克隆：细胞水平上的克隆。如杂交瘤细胞克隆。个体克隆：动物（植物）克隆

动物克隆：通过无性繁殖的手段，获得的遗传背景一致的动物群体。

细胞核移植技术——核心技术卵裂球培养技术胚胎分割技术目前哺乳动物的克隆方法主要有以下几种：

胚胎分割

胚胎细胞核移植

胚胎干细胞核移植

体细胞核移植

动物克隆的关键技术：核移植核移植技术概念:

利用显微操作仪将外源细胞的核移入去核卵母细胞中，经人工活化和体外培养后，再移植入代孕母体内，使其发育为含有与供体细胞相同遗传物质的个体。现在一般将细胞核移植技术得到的动物称之为克隆动物，是目前动物克隆的主要方法。

核移植的发展历史1952年，美国人罗伯特•布里格斯和T.J.金对豹蛙发育到囊胚期的胚胎细胞做移核试验，成功地获得了一个可以摄食的豹蛙幼体。1958年-1962年，英国剑桥大学利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾。1962年，童第周进行鱼类不同亚科间的核移植获得成功。20世纪80年代，哺乳动物克隆技术迅速发展。1981年,Illmensee和Hopper首次报道将鼠ICM细胞核移植到去核卵母细胞,经过体外培养，有34%的重组胚胎发育为桑椹胚。这种胚胎移入受体后，19%发育产仔。这是在哺乳类第一次用胚胎细胞进行核移植获得成功。

1986年,Willadsen首次报道在绵羊，采用去核的成熟卵母细胞做核受体与8-细胞的单个分裂球重构产生胚胎，首次应用电融合的方法克隆出一只小羊。1997年2月17日，英国科学家Wilmut等报道，利用体细胞核移植技术成功获得了克隆绵羊“多利”(Dolly)。2000年6月，西北农林科技大学成功获得成年体细胞克隆山羊，标志着我国动物体细胞克隆技术的崛起。2001－2004年，山东莱阳农学院、中科院动物所、中国农业大学等相继获得几十头体细胞克隆牛出生。2003年9月中科院动物所与法国科学家合作，发明了能够精确控制大鼠卵细胞自发活化的专利技术，在国际上率先成功克隆出大鼠。这些成果表明我国在动物体细胞克隆的各项技术指标已达到国际先进水平，在一些技术方面居国际领先水平。在异种克隆方面，我国也有一些领先于国际水平的方面，例如中科院动物所和西北农林科技大学都获得大熊猫异质克隆囊胚。将大熊猫的体细胞核植入去核后的兔卵细胞中，成功地培育出了大熊猫的早期胚胎。

供体细胞核的来源体细胞核移植胚胎细胞核移植胚胎干细胞核移植供受体种间关系异种核移植同种核移植核移植目的生殖性克隆治疗性克隆

核移植技术的分类胚胎细胞核移植将一个多细胞胚胎的细胞核,通过显微手术和细胞融合的方法,移植到一个去核卵母细胞中,构成新胚胎(克隆胚胎),然后移植给受体,获得与核供体胚胎基因型相同的后代(克隆动物)的生物技术。具有全能性，以其作为核供体进行核移植较容易成功。是克隆哺乳动物供核细胞最佳来源。成功的获得了克隆鼠、克隆羊、克隆猴等。体细胞核移植是指成体动物细胞核经显微手术和细胞融合的方法，移植到去核的卵母细胞内，或将体细胞核直接注入到去核卵母细胞质中,重新组成胚胎并使之发育乃至产生子代。诱导已分化的细胞进入G0期，恢复其全能性。“血清饥饿法”恢复体细胞核全能性。体细胞核移植的过程卵母细胞去核供体细胞核电刺激使两细胞融合重组细胞重组胚胎新个体核移植技术克隆羊培育过程黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期胚胎胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利绵羊“多莉”整个克隆过程如下：母绵羊A乳腺细胞

（体细胞）

母绵羊B未受精的卵细胞

母绵羊C“多莉”新的卵细胞发育成胚胎去核卵细胞提取细胞核细胞融合胚胎移植核移植技术的一般操作程序核受体的处理和制备核供体的处理和制备核移植重组胚的培养胚胎移植核受体的准备核受体：去核卵母细胞超排卵处理，获得体内成熟的卵母细胞卵母细胞来源收集卵巢，吸取卵丘－卵母细胞复合体，体外培养成熟

卵母细胞去核是否完全除去卵母细胞中期染色体，会影响克隆胚胎的发育能力,如果去除不完全,可导致克隆胚胎染色体的非整倍性,造成卵裂异常、发育受阻和胚胎早期死亡等。常用去核方法有:①盲吸法:用微细玻璃管在第一极体下盲吸,将第一极体、部分胞质(含中期染色体)除去。②半卵法:在透明带上做一切口,用微细玻璃管吸去一半细胞质至另一空透明带内,即将卵母细胞分为两半,然后用Hoechst33342染色确定不含染色体的一半为胞质受体。③功能性去核法:使Hoechst3342与卵母细胞DNA结合后,用紫外线照射,使核丧失功能。核供体的准备条件：核供体细胞具备完整二倍体。供体核在受体细胞质的作用下，产生细胞分化的逆转，重新回到发育过程的原点，恢复全能性。胚胎卵裂球分类胚胎干细胞体细胞卵裂球分离获取较大数量的同源性供体核,是提高细胞核移植，克隆胚胎效率的重要途径之一。胚胎发生致密化后,胚胎细胞间发生紧密连接,形成桥粒,使卵裂球分离的技术难度增加,常导致其死亡。致密期前的胚胎比致密期后的胚胎更容易提供供体核。采用蛋白酶K或链酶蛋白酶一次消化兔16～32细胞胚的粘蛋白层及透明带,在无Ca2+-PBS中轻轻吹打分离卵裂球,可获得较理想的效果。卵裂球的分离方法常常导致实验的不稳定性,影响细胞核移植克隆胚胎的效率。胚胎干细胞核移植：

将胚胎原始生殖细胞经过抑制分化培养，得到具有全能性的细胞系，进行核移植，得到克隆后代。成功率较高。体细胞核移植：体细胞又分为胎儿体细胞和成年体细胞，如胎儿成纤维细胞、卵丘细胞、颗粒细胞、乳腺上皮细胞、皮肤成纤维细胞等。胚胎细胞克隆的应用最普遍，体细胞克隆的意义最大。将核供体细胞移入去核卵母细胞；卵母细胞激活及非侵害性膜融合技术；重组胚的培养及移植技术。从技术上讲，难度较大的仍属卵母细胞的去核和核供体细胞移入去核卵母细胞这两个过程细胞核移植细胞质内注射法：用注核针吸取供体核，直接注射进卵母细胞胞质内。透明带下注射法：将供体核注射到透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，用电刺激进行融合。卵母细胞的激活受体卵母细胞胞质的激活,是影响克隆胚胎发育的关键因素之一。原理：通过电刺激、钙离子载体等方法，解除卵母细胞MⅡ期的抑制，转入到继续发育状态。移核操作后,电诱导融合的同时,也可激活卵母细胞,但激活率不高。卵母细胞的激活率与成熟时间密切相关,稍晚期卵母细胞激活率较高。钙离子载体或锶离子载体激活小鼠卵母细胞的能力高于电激活方法。化学试剂也可使卵母细胞激活。如5％乙醇、5umol/L离子霉素等处理。重组胚的体内或体外培养克隆胚胎需经一定时间的体外培养,才可移植给受体。家兔克隆胚胎在体外培养24小时以内,即可通过手术法移植给受体;而牛和羊克隆胚胎,所需培养时间较长（4-7天）,一般在其发育至桑椹胚及囊胚时移植。体外培养时间延长，可能影响克隆胚胎移植受体后的发育,造成胚胎死亡增加、巨犊综合症和难产。1切开卵母细胞透明带2挤出卵母细胞细胞核3注入供体细胞核4电融合仪融合培养12345胚胎移植受体母畜选择：颜色与供体品种不同，繁殖能力强、体格稍大的当地品种。移植部位：输卵管、子宫角牛克隆胚胎发育至囊胚阶段移植给受体,妊娠率可达53.3%.家兔细胞核移植克隆胚胎的移植妊娠率低(4%～10%)区分两种核移植同种核移植：将一种动物的体细胞核移植到同种动物的去核（遗传物质）卵母细胞中。

如克隆羊“多利”异种核移植：将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核（遗传物质）卵母细胞中。多用于濒危物种。异种核移植1999年，陈大元等将成年大熊猫体细胞作为供核体细胞，移植到去核日本大耳白兔卵母细胞中，成功地构建异种重构胚，体外培养获得囊胚。染色体分析和DNA检测均表明，重构囊胚的细胞核来自大熊猫，细胞质中含有大熊猫的线粒体DNA。2001年，将重构胚移植寄母子宫，获得了着床的重大进展。2002年，不仅异种重构胚能够在异种寄母子宫中着床，而且还能发育。保护濒危物种细胞核去核卵母细胞核移植重构胚异种克隆研究面临着许多问题：如体细胞核能否在异种卵胞质中去分化并支持早期胚泡发育？异种核质能否相容？异种重构胚能否着床并进行全程发育等问题。

核移植技术存在的问题成功率低，1％～5％，畸胎、死胎等问题。理论研究与技术研究比较，相对滞后。体细胞克隆后代可能出现老化现象。核移植技术环节还需完善。核移植技术的应用制备转基因克隆动物，进行生物药物生产克隆技术与基因疗法的结合，使得遗传疾病治疗成为可能。例如，为治疗遗传缺陷，可将修改后的基因导入早期胚胎细胞，使其具备正确的基因，然后将此正常细胞核移入去核卵母细胞中，再将胚胎移入母体，即可发育成正常的胎儿。

利用克隆技术可以产生人体所需的内脏器官，用于器官移植或替换体内衰老及发生病变的器官。例如正在进行的利用克隆猪提供人类器官的研究，即是先把引起人类对猪器官免疫排斥反应的基因敲除后,将人类基因整合到猪细胞的基因组中，克隆出可供人类器官移植用的带有人类基因的猪器官。异种器官移植

可移植器官短缺猪的器官大小、结构和功能上与人体器官相近

急性免疫排斥反应

基因敲除半乳糖基转移酶

核移植基因敲除克隆猪器官移植与干细胞技术结合，开展治疗性克隆治疗性克隆：指通过核移植技术，构建来源于病人体细胞的胚胎，待胚胎发育至囊胚阶段后取出内细胞团，在体外培养胚胎干细胞，然后定向诱导胚胎干细胞分化成病人所需要的细胞类型，然后再移植回病人身上。或通过组织工程构建病人所需要的组织或器官，移植给病人，来替代或补充病变或受到损伤的细胞、组织和器官，从而实现对疾病的治疗。例如治疗帕金森氏病和糖尿病等。治疗性克隆胚开展异种动物克隆，拯救濒危动物培育优良畜种，扩大良种种群研究生物学基本理论问题濒危物种的克隆CC!克隆有什么风险？失败率高发育过程中的问题异常的基因表达端粒的差异失败率高去核卵细胞与转移的细胞核达不到同步转移进新细胞核的卵细胞可能不分裂或错误分裂，产生畸形胚胎

将胚胎移植到代孕母体子宫中的过程可能失败怀孕过程可能失败

发育过程中的问题法国国家农业研究院的研究人员在1999年就透露，克