实验五 酵母菌形态的观察和显微镜下细胞测量和计数

#实验五酵母菌形态的观察和显微镜下细胞测量和计数刘洋生物1011002040120一、实验目的1、观察酵母菌的形态，掌握区分酵母菌死活细胞的染色方法。2、掌握利用显微测微尺测量酵母菌人小的方法。3、学习利用血球计数板测定微生物细胞数量的原理和方法。二、实验原理（一）酵母菌的形态观察酵母菌是单细胞真核微生物，细胞呈圆形、椭圆形或柱状。酵母的细胞比细菌人得多，经过特殊的染色，在高倍镜下就可以观察到。酵母菌既可无性繁殖，又可有性繁殖。无性繁殖有芽殖和裂殖两种，芽殖又有单出、双出和多出之分。酵母菌的有性生殖一般能形成4〃8个子粪饱子。在一定条件卞，有的酵母菌进行芽殖后，长人的子细胞不与母细胞立即分离，并继续出芽，细胞成串排列，这种菌丝状的细胞串就称为假菌丝。假菌丝的各细胞间仅以狭小的面积相连，呈藕节状。酵母菌的死活细胞可以通过美兰染色加以区分。美兰是一种无毒性染色剂，其氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞具有较强的还原能力，可以使美兰由蓝色的氧化型转变为无色的还原型。处于代谢旺盛的细胞还原美兰的能力强，细胞为无色，为代谢缓慢的老细胞、幼嫩芽体为浅蓝色，死细胞为深蓝色。（-）显微镜下的细胞计数本次实验采用血球计数法测定微生物细胞数。方法是将经过适当稀释的菌体细胞或抱子悬液，加到血球计数板的计数室内，在显微镜下逐格计数。因为计数室的容积是固定的（0.1mm3）,所以可以将在显微镜下计得的菌数换算成单位体积试样中的菌数。血球计数板使一块特制的载玻片，中部有H形的沟槽将中部分成上下两个计数室。计数室方格的边长为3mm,每个方格分为9个人方格，正中央的人方格被分为25个中方格，而每个中方格又被分为16个小方格。这样正中央的人方格总共分成400个小方格，每个小方格的体积为l/4000mm3（计数室的高度为0.1mm）o由此得到如下公式：/、平均每个中方格内的菌数每亳升的菌数（个）=————J…%桶释倍数x4000x1000（三）显微镜下细胞大小的测量用来测屋微生物人小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺专用于校正目镜测微尺每格的长度，是中央部分可有精确等分线的载玻片。全长1mm,等分为100小格，每小格长lO^io目镜测微尺的刻度刻在一个略小于目镜内径的圆玻璃片上。将此测微尺放在目镜内观察物彖时，可同时看见物象和测微尺，但是在配合不同放人倍数的物镜时，目镜测微尺每刻度间的长度会发生变化。所以，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，使用前必须利用镜台测微尺进行校正。三、实验材料1、菌种：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、热带假幺纟酵母（Candidatropicalis）2、染色剂：0.2%美兰染液3、培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）4、其他：血球计数板、镜台测微尺、目镜测微尺、载玻片、盖玻片、无菌水、洗瓶、擦镜纸、吸水纸、二甲苯、香柏油、接种用具

四、实验方法（一）酵母菌的形态观察2、芽殖观察（2）制片：取一洁净载玻片，在其中央滴一滴美兰染液，用接种环取少量酿酒酵母菌苔在染液中涂匀。再用蹑子取一盖玻片，以45°角与菌悬液接触后，轻轻盖在菌悬液上，避免产生气泡，用吸水纸吸干多余液体。（2）观察：将水压片置于高倍镜卞观察。观察芽殖和死、活细胞的颜色。30min之后，再次观察死、活细胞数是否发生了变化。2、假菌丝的观察（1）培养：将热带假丝酵母划线接种与马铃萼葡萄糖培养基平板表面，28'C培养2天，取出培养物,在无菌条件下，将一实现灭菌的无菌盖玻片轻轻压在划线处，继续培养2天。（2）观察：打开培养皿盖，与高倍镜下直接观察3、酿酒酵母菌子囊范子的观察于高倍镜下观察子囊孑包子装片，注意子囊抱子的数目和形状。（二）显微镜下的细胞计数1、制备菌悬液：用无菌接种环在酿酒酵母菌斜面上刮卞适量菌苔，将菌苔分散在盛有5ml无菌水的试管中，充分振荡。2、加菌液：先用擦镜纸将血球计数室擦净，用无菌滴管取着凉酿酒酵母菌悬液滴入上下两个计数室内，盖上盖玻片，不能有气泡，否则重做。3、计数：现在显微镜下找到计数室，在正中央的大方格中沿对角线取9个中方格，计数每个中方格中的菌数，填入下表，并计算单位体积的菌数（个/ml）。（三）显微镜下细胞大小的测量2、校正目镜测微尺（1）安装目镜测微尺：取出目镜，旋开透镜螺旋，将目镜测微尺刻度朝卞放入目镜筒，然后旋好螺旋，插入显微镜筒。（2）放置镜台测微尺：将镜台测微尺放在载物台上，使刻度面朝上。（3）校正：在显微镜卞观察，调准焦距，当看清镜台测微尺后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，然后移动推动器，使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两条刻度线完全重合，在数出两条重合先之间各自所占的格数，根据公式得到校正后的目镜测微尺每小格的长度。目镜测微尺每小格的长度Gum）目镜测微尺每小格的长度Gum）=两条重合线间镜台测微尺的格数x10

两条重合线间目镜测微尺的格数2、制酿酒酵母水压片：取一洁净载玻片，在中央滴一滴上面制备的菌悬液，小心盖上盖玻片，用吸水纸将多余的液体吸干，不能产生气泡。3、测量酿酒酵母菌体人小：将酿酒酵母水压片放在载物台上，在显微镜下看清菌体后，转动目镜测量酵母细胞菌体的直径，共需测量20个细胞。五、实验结果及分析（一）酵母菌的形态观察1、美兰染色后，观察到视野中细胞呈圆形或椭圆形，人部分呈白色，少部分呈蓝色。可见芽殖，较人

的母体细胞旁边有一较小的芽体，母体细胞白色，芽体浅蓝色。而在子囊泡子的观察中，可见四个呈菱形的子囊范子靠在一起，相互之间以及范子于坏境之间都有透明的子囊壁隔开。芽殖和子囊施子如下图1所示。2、假菌丝的观察（-）显微镜下的细胞计数将计得菌数填入卞表2。表2酿酒酵母的血球计数板计数格数123456789平均数数目5665765345375根据公式，计算所得单位体枳的菌数如卜•:

每亳升的菌数（个）=平均每个中方格内的菌数16X桶释倍数X4000X10005.37516每亳升的菌数（个）=平均每个中方格内的菌数16X桶释倍数X4000X10005.37516（三）显微镜卞细胞人小的测量1、目镜测微尺的校正结果表2目镜测微尺刻度的校正物镜物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长（pm）高倍镜402052.52、测量结果表3酿酒酵母细胞人小的测量菌细胞编号123456目镜测微尺格数（长轴）4.34.34.53.24.65.2目镜测微尺格数（短轴）4.34.12.52.74.13.6菌体大小（um*um）115.6110.270.354.0117.9117.0菌细胞编号78910平均数目镜测微尺格数（长轴）4.54.94.14.94.4目镜测微尺格数（短轴）1.82.52.72.83.6菌体大小（um*um）50.676.669.285.896.5由上表可知，酿酒酵母细胞平均人小为4・4X3・6pm,而细胞的人小范圉是（3・2~5・2）X（2・8~4・3）屮m3、班级数据汇总：3.1酿酒酵母的血球计数板计数(EB藝昱=込0&0_(EB藝昱=込0&0_denistyMin.:1750001stQu.:1087500Median:1500000Mean:38399583rdQU.:3527778Max.:39444444

3.2酿酒酵母细胞人小的测量描述性统汁结果:ID_O长鞘ID_O长鞘Min.:3.3101stQu.:6.362Median:9.100Mean:8.2803rdQU.:10.012Max.:16.200短轴Min.:1.6101stQu.:3.975Median:5.885Mean:5.4853rdQU.:7.135Max.:11.900长轴短轴酵母细胞大小测量六、思考题用美兰染色时，如何在光学显微镜下区分酵母细胞代谢活性的强弱？用光学显微镜观察酵母菌体时，其在制片和染色方面与细菌有何差别？为什么说热带假丝酵母的菌丝是假菌丝？七、总结1＞制备待计数菌悬液时，为避免无菌水中菌体密