温度和ph对小丑鱼消化酶活性的影响

温度和ph对小丑鱼消化酶活性的影响

研究鱼类胃肠道各部分的消化酶活性，是了解鱼类消化生理的重要内容之一。它对了解鱼类的营养成分的特点，改进鱼类的饲养方法，降低饲养成本具有重要意义。消化酶活性与鱼类摄食和生理具有密切的关系,而温度和pH是影响消化酶活性重要的因素。目前,国内外许多学者对鱼类消化酶的研究进行了报道。Ribeir等研究了塞内加尔鳎幼鱼消化酶活性的最适温度和pH。倪寿文等研究了草鱼(Ctenopharyngodonidella)鲤鱼(Cyprinuscarpio)、鲢鱼(Hypophthalmichthysmolo-trix)、鳙鱼(Aristchthysnobilis)、罗非鱼(Tilapianilotica的肝胰脏和肠道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性及pH值。沈文英研究报道了银鲫(Carassiusauratus)的消化酶活性与pH值的关系。寿建昕等研究了翘嘴红鲌(Erythroculterilishaefoumis)消化道内主要消化酶的最适温度和pH值。公子小丑鱼(Amphiprionocellaris)隶属于鲈型目(Perciformes)、雀鲷科、海葵鱼亚科、双锯鱼属,其外观美丽,是一种重要的热带珊瑚礁观赏性鱼类。美国以及东南亚地区对于小丑鱼类的繁殖技术已较成功,并进行了商业化生产。我国广州、上海、温州等地对其也成功进行了人工繁殖,并有一定数量进入商业化市场。王斌等报道了眼斑双锯鱼的人工繁育技术,滕力平等研究了二线小丑鱼的人工繁殖,鲍鹰等研究报道了红小丑的人工繁殖和育苗。虽然对于小丑鱼类的繁殖发育以及生长等已有较多的研究和实践,但有关公子小丑鱼消化酶活性影响的研究尚未见报道。因此,本研究首次对公子小丑鱼幼鱼胃、肝脏、肠道消化酶活性进行了测定,并讨论了pH和温度对酶活性的影响,更精确地反映了其食性,以期为了解公子小丑鱼的消化生理特点和人工配合饵料的研制提供理论依据。1材料和方法1.1鱼类健康无病试验所用公子小丑鱼幼鱼取自上海海洋大学水产与生命学院养殖中心,鱼体健康无病,摄食正常。共挑选幼鱼45尾,体重1.50(±0.31)g、体长3.91(±0.35)cm。1.2消化酶活性测定1.2.1温度设置以5℃为梯幅,3种消化酶活性测定的温度范围为20~45℃,共设6个梯度,分别是20、25、30、35、40、45℃。在试验测定中其他条件和环境不变,温度由恒温水浴锅控制。1.2.2pH设置胃蛋白酶活性测定采用柠檬酸-磷酸盐缓冲体系,其他采用磷酸盐缓冲体系。胃蛋白酶活性测定pH值范围为2.0~3.0和6.0~8.0,梯幅分别为0.2和0.5,共设11个梯度。胃淀粉酶、脂肪酶和肝脏和肠道消化酶活性测定pH值范围为6.0~8.0,梯幅为0.5,共设5个梯度。在测定中其他条件和环境不变。1.2.3粗酶液制备粗酶液的制备方法参照尹彦强所用方法,并稍作修改。将公子小丑鱼放置于冰盘上解剖,取胃、肝脏、肠道并剔除附着物,用最小感量(0.1mg)电子天平精确称重。将所取待测组织装入5mL灭菌冻存管中,立即冷冻。随后加入样品体积约10倍重pH7.0双蒸水,在4℃下使用高速匀浆机匀浆,置于4℃冰箱保存20~28h后,使粗酶提取液尽可能溶解,采用高速冷冻离心机离心(6000r/min,10min),收集上清液并置于4℃冰箱保存,24h内检测酶活力。1.2.4酶活性测定采用Folin-酚显色法测定蛋白酶活性,采用3,5二硝基水杨酸显色法测定淀粉酶活性,采用以聚乙烯醇橄榄油为底物的标准氢氧化钠溶液滴定法测定脂肪酶活性。1.3数据分析采用SPSS17.0和MicrosoftExcel对试验数据进行统计分析。2结果与分析2.1温度对材料活性的影响2.1.1温度对蛋白酶活性的影响温度对蛋白酶活性的影响结果(图1)显示,在20~45℃范围内,公子小丑鱼胃、肝脏和肠道蛋白酶的最适温度均为40℃。胃蛋白酶活性明显高于肝脏和肠道,活性大小顺序为胃>前肠>中肠>后肠>肝脏。在20~40℃范围内,胃、肝脏和肠道蛋白酶活性均随温度升高而增加,在40℃达到最大,超过40℃时活性均随之下降,其中后肠和肝脏变化趋势相对缓和。这表明温度对公子小丑鱼胃蛋白酶影响远大于肝脏和肠道。2.1.2温度对淀粉酶活性的影响温度对淀粉酶活性的影响结果(图2)显示,在20~45℃范围内,公子小丑鱼胃淀粉酶的最适温度为40℃,肝脏淀粉酶的最适温度为35℃,前肠、中肠和后肠淀粉酶的最适温度均为30℃,活性明显。活性大小顺序为前肠>中肠>肝脏>后肠>胃。前肠、中肠和后肠淀粉酶活性均在30~45℃之间变化显著,胃淀粉酶活性在20~40℃之间变化相对较小,各部位在40℃以上活性较低。这表明肠道和肝脏淀粉酶活性受温度影响较大,而胃淀粉酶活性受温度影响较小。2.1.3温度对脂肪酶活性的影响图3显示,在20~45℃范围内,胃、肝脏、前肠、中肠和后肠脂肪酶的最适温度均为40℃。活性大小顺序为胃>前肠>中肠>后肠>肝脏。各部位脂肪酶活性在20~35℃之间变化趋势缓和,活性较低,而在35~45℃之间变化趋势显著,活性明显。这表明较高的反应温度对脂肪酶活性影响较大。2.2ph对淀粉酶活性的影响2.2.1pH对蛋白酶活性的影响pH对蛋白酶活性的影响结果见图4。在pH值为2.0~8.0范围内,测得公子小丑鱼胃蛋白酶最适pH值为2.2;在pH值为6.0~8.0范围内,测得肝脏、前肠、中肠和后肠蛋白酶最适pH值分别为7.5、7.0、7.0和8.0,活性大小顺序为胃>前肠>中肠>肝脏>后肠。这表明胃蛋白酶在强酸性环境下活性最大,而肝脏和肠道蛋白酶在中性和弱碱性下活性较高。2.2.2pH对淀粉酶活性的影响pH对淀粉酶活性的影响结果(图5)显示,在pH值为6.0~8.0范围内,胃肝脏、前肠、中肠和后肠淀粉酶最适pH值分别为7.06.0、7.0、7.0和7.0,活性大小顺序为前肠>中肠>肝脏>后肠>胃。这表明各部位淀粉酶均在弱酸性和中性环境下发挥活性,说明pH对肠道和肝脏影响较大,而对胃影响不明显。2.2.3pH对脂肪酶活性的影响pH对脂肪酶活性的影响结果(图6)显示,在pH值为6.0~8.0范围内,各部位脂肪酶活性均呈先上升后下降的趋势。除肝脏脂肪酶最适pH值为7.0外,胃、前肠、中肠和后肠脂肪酶最适pH值均为7.5,活性大小顺序为前肠>肝脏>中肠>胃>后肠,且活性大小相差较小。这表明各部位脂肪酶活性在中性和弱碱性下相对较高。3结论和讨论3.1消化酶最适温度的确定温度对鱼类消化酶活性具有显著影响,不同酶类因其结构差异,最适温度不同。在一定的温度范围内消化酶催化反应速度随着温度升高而加快,当超过最适温度时,消化酶活性就会随之降低或失活。沈文英报道了澳洲宝石鱼蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最适温度分别为50、30、35℃。梅景良等研究结果表明,黑鲷蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最适温度分别50、40、30℃。李希国等在研究黄鳍鲷消化酶中指出,温度对胃和肠道蛋白酶活性影响较大。在本试验中,公子小丑鱼蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性在不同温度下显然不同。其中胃、肝脏、前肠、中肠和后肠蛋白酶和脂肪酶的最适温度均为40℃,胃淀粉酶的最适温度为40℃,肝脏淀粉酶最适温度为35℃,前肠、中肠和后肠淀粉酶的最适温度均为30℃。3种酶活性的温度变化趋势基本一致,均随着温度升高而增加,达到最适温度后,随温度升高而降低。说明温度对公子小丑鱼蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶的影响较大。尾崎久雄认为,鱼类消化酶的最适温度范围一般在30~50℃,这与本试验研究结果基本一致。将消化酶的最适温度与实际环境温度进行比较,蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最适温度均高于公子小丑鱼栖息的环境温度,这是目前研究鱼类消化酶最适温度普遍现象,与叶元土等的研究结果相符合。由于消化酶最适温度的测定是在离体条件下进行的,所测得结果只是在一定条件下反映消化酶的耐热程度及温度对酶活性的影响规律。3.2ph值对生物酶活性的影响鱼类消化道内的pH在空腹和饱腹时差异明显。pH对鱼类消化生理具有显著的影响,是改变鱼类消化酶活性的重要因素之一。消化酶只有在适应的pH范围内,才能体现其活性。pH一方面能为消化酶提供适宜的酸碱环境,一方面调节食物消化后消化道内酸碱度。本试验结果表明,公子小丑鱼不同部位蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最适pH值有所不同,其胃、肝脏、前肠、中肠和后肠蛋白酶的最适pH值分别为2.2、7.5、7.0、7.0和8.0,公子小丑鱼肝脏淀粉酶的最适pH值为6.0,胃、前肠、中肠和后肠淀粉酶的最适pH值均为7.0。胃蛋白酶和肝脏淀粉酶在酸性条件下活性相对稳定,肝脏和肠道蛋白酶与胃和肠道淀粉酶在中性和弱碱性条件下活性较高,胃蛋白酶活性明显高于肝脏和肠道。李希国等研究表明,黄鳍鲷胃、肝脏和肠道蛋白酶的最适pH值分别为2.8、7.0和7.4,罗奇等报道,条石鲷幼鱼胃、肝脏和肠道淀粉酶的最适pH值分别为7.6、6.6和6.6,与本研究结果相近。本研究结果显示,公子小丑鱼肝脏脂肪酶的最适pH值为7.0,胃、前肠、中肠和后肠脂肪酶均为7.5。Koven等研究报道了大菱鲆消化道内脂肪酶的最适pH值范围呈中性和弱碱性,陈苏维研究泥鳅发现,其消化道各部位脂肪酶活性最适pH值均为7.0,这与本试验结果相似。因此,在公子小丑鱼幼鱼养殖实践中及时调整饵料成分配比和投喂量,保持幼鱼生存水体具有稳定的pH,以促进幼鱼生长,提高饵料吸收率,节约养殖成本。3.3生物酶活性测定结果鱼类的消化生理与食性具有密切的关系,食性与消化道结构和消化能力是相适应的。一般情况下,肉食性鱼类和植食性鱼类在消化道方面上的区别显著,肉食性鱼类相比植食性鱼类消化道较短,食物蛋白质含量要求较高,消化道内蛋白酶活性强于淀粉酶,而植食性鱼类消化道内食物纤维素等含量较高,淀粉酶活性比较强。本试验结果表明,公子小丑鱼在适宜的温度和pH环境下,消化道各部位蛋白酶活性明显高于淀粉酶和脂肪酶,并且发现其消化道相对较短,公子小丑鱼幼鱼的比肠长为0.56(±0.097),介于大鳍鳠Mystumacropterus(比肠长为0.531±0.061)、鲇SilurusasotuLinnaeus(比肠长为0.726±0.0087)、黄姑鱼Nibealbiflora(比肠长为0.90±0.066)之间,这说明公子小丑鱼是偏肉食性鱼类。吴婷婷研究6种淡水鱼类指出,杂食性鱼类蛋白酶活性介于肉食性与草食性鱼类之间,而淀粉酶和脂肪酶与食性的相关性不明显Cowey研究认为,饵料的成分、种类和特性等对鱼类消化酶活性具有不同的影响。在公子小丑鱼养殖过程中适当提高饵料成分中蛋白质的含量,有利于促进鱼体的生长。3.4生物酶活性测定Sagiv在研究鱼类仔稚鱼期和幼鱼期消化酶时发现,绝大部分鱼类幼鱼期消化道内各部位消化酶活性明显并低于成鱼。马燕梅认为鱼类消化道内不同部位蛋白酶具有不同性质,而胃蛋白酶活性在酸性环境下较高。本试验结果表明,在最适温度和pH下,公子小丑鱼胃蛋白酶