第九章 微生物遗传与变异

第九章微生物遗传与变异

通过本章的学习，要求掌握：1、细菌基因重组的原理和方法。2、真菌基因重组的原理和方法。3、微生物诱变育种的原理和方法。4、基因工程的基本原理。5、基因表达的调控。重点：细菌的基因重组难点：低频转导，高频转导，准性生殖1

证明核酸（DNA或RNA）是遗传的物质基础简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题微生物与高等生物具有共同的遗传本质第一节：微生物的遗传物质一、证明核酸是遗传物质的3个经典实验结论：2Prusiner(1982)提出羊搔痒病因子是一种蛋白质侵染颗粒（proteinaceousinfectiousparticle），并将之称做Prion或Virino。

-------朊病毒1997年，StanleyB.Prusiner荣获诺贝尔奖3朊病毒的发现和思考:朊病毒一种具有传染性的蛋白质致病因子蛋白质是遗传物质吗?蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？已知的传染性疾病的传播因子必须含有核酸4二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和形式(一）遗传物质在微生物细胞中的存在方式①真核生物DNA分子与组蛋白结合构成染色体，每条染色体有单一线性双链DNA分子。一个真核生物细胞内有多条染色体（脉孢菌7条，人23条）。高等生物中有2至多套染色体（动物2倍，水稻4倍），真菌有双倍体，但多数微生物是单倍体。真核细胞核物质外有核膜包围，形成完整细胞核。5②原核生物DNA不与组蛋白结合，染色体仅由一条DNA组成，DNA为共价闭合环状双链，一个细胞内只有一条染色体（单倍体haploid）。无核膜膜包围，只在细胞中央形成核区。③质粒plasmid和转座因子原核生物中，除染色体以外，能够自主复制的共价闭合环状DNA分子。它们携带少量遗传基因，决定细胞的某些性状，并非细菌生活必需。61、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平（二）遗传物质在7个水平上的形式71、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的82、细胞核水平真核生物细胞核核染色体原核生物核区DNA链核基因组在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质93、染色体水平染色体的数目在不同的生物中是不同的真核生物染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构真核生物通常为多倍体原核生物的染色体只有闭合环状的DNA链原核生物为单倍体104、核酸水平核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力手段。115、基因水平一切具有自主复制能力的遗传功能单位都称为基因。它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的DNA片段。

1909年丹麦生物学家W．Johansen12结构基因：是为细胞结构、组成(如细胞生化反应所需的酶)及完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。调节基因：用于编码调节蛋白的基因。操纵基因：是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转录是否能进行。

重复基因：DNA片段重复跳跃基因：可在DNA上转移位置的基因（IS因子、Tn因子）

136、密码子水平14核苷酸是最小突变单位和交换单位7、核苷酸水平15（三）转座因子转座因子：细胞中能改变自身位置（例如从染色体或质粒转移到另一个位点，或者在两个复制子之间转移）的一段DNA序列。插入序列（insertionsequence,IS)转座子（transposon,Tn)某些病毒（Mu噬菌体）原核生物的转座因子：16Ⅰ型Compoundtransposons：两端为IS，抗性基因居中。如Tn5、Tn9、Tn10、Tn4001、Tn4003。Ⅱ型Complextransposons：两端为IR(30-50bp)，中间为转座基因和抗性基因。如Tn1、Tn3、Tn21、Tn1721、Tn551。基因转座genetransposition转座子的特征是在两端有IR序列,分两类：17转座的遗传学效应：1）插入突变2）产生染色体畸变3）基因的移动和重排18(四)质粒1、致育因子(Fertilityfactor，F因子)3、产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）2、抗性因子（Resistancefactor，R因子）4、毒性质粒（virulenceplasmid）5、代谢质粒（Metabolicplasmid）6、隐秘质粒（crypticplasmid）19第二节：微生物的基因组结构明确基因组的概念三种代表性微生物基因组结构的特点，特别强调古生菌基因组的独特性及双重特征20微生物基因组结构的特点:1、原核生物（细菌）的基因组1）染色体为双链环状的DNA分子（单体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的

3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；5）基因组的重复序列少而短.基因组genome：一种生物的全套基因。21222、真核微生物（啤酒酵母）的基因组1）典型的真核染色体结构；啤酒酵母基因组大小为13.5×106bp，分布在16条染色体中。2）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）或内含子序列；4）重复序列多.第一个完成基因组测序的真核生物基因组23243、古生菌（詹氏甲烷球菌）的基因组第一个完成基因组测序的古生菌1)只有40％的基因与其他两界的生物有同源性2)古生菌的基因组在结构上类似于细菌1.66x106bp的环状染色体DNA1682个ORF(OpenReadingFrame)3)负责信息传递功能的基因（复制、转录和翻译）则类似于真核生物25克隆clone不经过有性细胞的结合，由体细胞发育成新个体，即无性繁殖。基因重组generecombination两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基因的重新组合，形成新的基因型的过程。原核微生物没有有性生殖，其基因重组通过转化、接合、转导方式进行。第三节原核微生物的基因重组26一、细菌的接合作用(conjugation)1.实验证据

通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程27接合(conjugation)通过供体菌与受体菌间细胞接触而传递大段DNA1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.TatumE.colik12的多重营养缺陷型杂交实验中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。28证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（BernardDavis，1950）29接合机制(大肠杆菌的接合机制)

接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。30中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！为何采用多重营养缺陷型菌株？尽可能地排除回复突变对实验结果的干扰！311）可经接合作用而获得2）可通过一些理化因素(如吖啶橙、Ni2+、Co2+、利福平、丝裂霉素C、硫酸十二酯钠、亚硝基胍、溴化乙锭、环己亚胺和加热等)的处理，而从细胞中消失。3）在大肠杆菌中，F因子的DNA含量约占总染色体含量的2%F因子特点：32F因子大肠杆菌是有性别分化的。决定它们性别的因子称为F因子(致育因子或称性质粒)，呈超螺旋状态，既可以在细胞内独立存在,具有自主的与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中的能力,也可插入(即整合)到染色体上33F因子的四种形式：a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)，

F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。34c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上,因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞表面同样有性菌毛。35F+菌株 含F质粒，细胞表面产生性毛(sexpili)，与F-细胞相连，在接合后转移DNA。F-菌株 无F质粒，不产生性毛，可接受外来F质粒。36Hfr菌株高频重组菌株（highfrequencyrecombination）。与F-接合后，重组频率比F+高几百倍。当Hfr菌株与F-菌株接合时，Hfr染色体在F因子处发生断裂，由环状变成线状。整段线状染色体转移至F-细胞的全过程约需100min。由于转移过程常中断，越在前端的基因进入F-的机会就越多，在F-中出现重组子的时间就越早，频率也高。37F’菌株携带有F’因子的菌株，其性状介于F+与Hfr之间，这就是初生F’菌株。初生F’菌株与F-菌株接合，使后者转变成F’菌株，这就是次生F’菌株。以这种接合来传递供体菌基因的方式，称为F因子转导(F-duction)、性导(sexduction)

。在次生的F’群体中，大约有10%的F’因子重新整合到染色体组上，而恢复成Hfr菌。381）F+×F-杂交1）F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用；2）F因子的转移:双链之一被切断，一条链进入F-细菌3）进入F-细菌中的一条链复制出互补链,F-成为F+4）原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制F+＋F+392）Hfr×F-杂交Hfr菌株仍保持着F+细胞的特征。当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区和染色体DNA向受体细胞转移。F因子除先导区外，绝大部分处于转移染色体的末端，因转移过程常被中断，故F因子不易转入受体细胞中。Hfr×F-杂交后的接合子多数仍然是F-。染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。Hfr＋F-403）F′×F-杂交F′×F-与F+×F-的不同：供体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体；细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）F′＋F′411、普遍性转导（generalizedtransduction）(1)意外的发现1951年，JoshuaLederberg和NortonZinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！二、细菌的转导(transduction)421952年Zinder和Lederberg

在验证Salmonellatyphimurium是否也存在接合现象时发现了转导现象。S.typhimurium： LT22A(trp-)； LT2(his-)LT22溶原性→噬菌体P22→感染LT2（非溶原性）→可能释放带trp+的P22→LT22A(trp-)→呈原养型。43沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌

另一株是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）WhyandHow?44（2）转导（transduction）转导：由病毒介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式。一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。转导噬菌体：能将细菌宿主的部分染色体和质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体。获得了由噬菌体携带来的供体菌DNA片段的受体细胞称为转导子。在转导中被转移的染色体片段称为转导因子。

45细菌转导的类型：普遍转导低频转导高频转导局限转导完全转导流产转导46普遍转导（generalizedtransduction）噬菌体可误包供体菌中的任何基因(包括质粒)转导至受体细菌中，并使受体菌实现各种性状的转导47普遍性转导的三种后果：外源DNA被降解，转导失败。完全转导流产转导48完全转导completetransduction

： 进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子(transductant)49转导DNA不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物。流产转导：50局限性转导是噬菌体对寄主特定基因进行的有效转移溶原菌经诱导后，少数前噬菌体从宿主染色体脱落时产生错误切割，把宿主的某些基因整合到噬菌体的基因组上，当这样的噬菌体侵染另一宿主菌时，噬菌体DNA与受体菌的DNA同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上，使受体菌获得了供体的这部分遗传特性，从而形成转导子。局限转导（又叫特异转导）：specialized

transduction51如：λ前噬菌体位点两端是细菌染色体的gal＋和bio＋，经诱导后噬菌体与寄主DNA分离。但在极低的频率下会出现错切，从而使邻接的的细菌DNA被一起切除转导至受体菌。局限性转导包括低频转导和高频转导两种类型52低频转导：低频转导裂解物正常噬菌体极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）转导颗粒局限转导子（极少量）低感染频率形成转导子的频率只有10-4-10-653高频转导：形成转导子的频率很高,理论上可达50%。高频转导是双重溶源的结果：

λ─┐│＋E.colik12→[E.coliK12(λ/λdgal)F]λdgal┘ ↓UV转导噬菌体（λgal）→转导子菌落 辅助噬菌体（λ）→噬菌斑

54局限转导与普遍转导的主要区别：a）局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。55转化：指同源或异源的游离DNA分子（质粒和染色体DNA）被自然或人工感受态细胞提取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。这些被转化的游离的DNA片段称为转化因子。转化后的受体菌，称为转化子。

1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力三、细菌的遗传转化（genetictransformation）56

感受态细胞：受体菌最容易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态称为感受态。

进行转化，需要二方面必要的条件：1、建立了感受态的受体细胞2、外源游离DNA分子（转化因子）自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内转化因子通常是双链DNA。

57转化过程:

①感受态的出现②转化因子的吸附与掺入③转化因子的整合

58噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒转染(transfection)：转染的特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。59人工转化：用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。60五.原生质体融合原生质体融合：将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内、及属间）原生质体融合成为一个新的重组子的技术。原生质体融合步骤：1、原生质体制备2、原生质体融合和再生3、融合子的选择61微生物细胞融合的研究始于1976年。主要过程：先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子。62杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。

（一）有性生殖第四节真核微生物的基因重组能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交63（二）准性生殖准性生殖是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。它是类似于有性生殖，但比之更为原始的一种生殖方式，它可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。在半知菌类中最为常见。642、异核体形成1、菌丝联合3、核配4、体细胞交换和单倍体化

杂合二倍体只有相对的稳定性，在其繁殖过程中虽不进行减数分裂，但在有丝分裂中可以发生染色体交换和染色体单倍化，从而形成各种分离子。

准性生殖的过程：656667“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果所有生物的DNA在结构及特性上具有一致性让细菌代人受过！Ames试验：利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用68美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，因此称为Ames试验具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变69证明Ames试验重要性的应用实例：国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免70Ames试验71第五节、微生物诱变育种诱变育种：指利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。72诱变剂物理因素：紫外线、激光、离子束、X射线、r射线等化学因素：烷化剂、碱基类似物、吖啶化合物（2）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液（1）使用简便有效的诱变剂73（4）使用最佳的处理剂量

剂量=强度（浓度）×作用时间相对剂量=杀菌率处理剂量：是指处理因素对微生物的生物学效应74致死剂量：将微生物全部杀死的剂量亚致死剂量：将M大部分杀死，只留下很少的活菌体，如杀死99%以上，存活不到1%，或者杀死90%以上，存活在10%以下。弱致死剂量：杀死一大半，存活一小半，如杀死50-70%，存活30%-50%诱变处理一般选用亚致死剂量。

75（5）设计高效率筛选方案突变株的筛选：产量突变株的筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选76诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营养缺陷型富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）影印平板法生长谱法77第六节微生物基因表达的调控

一、操纵子（operon)的转录调控操纵子：一个或多个结构基因联接在一起，形成一个在结构和功能上协同作用的整体，受同一个调节基因、操纵基因(operator)和启动区（promoter)的调控。78promoteroperatorgen