第一章 蛋白质化学

蛋白质化学第一章第一节蛋白质的分子组成和分类第二节蛋白质的分子结构第三节蛋白质结构与功能的关系第四节蛋白质的理化性质及其分离纯化是由氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有复杂结构和特定功能的一类重要的生物大分子。蛋白质（protein）蛋白质存在于所有生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，参与了几乎所有的生命活动过程。1、蛋白质是生物体重要组成成分

分布广：所有器官和组织都含有蛋白质，细胞的各个部分都含有蛋白质。

含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45%，某些组织含量更高，例如：脾肺等高达80%。2、蛋白质的重要生物学功能

作为生物催化剂代谢调节作用物质的转运和存储免疫保护运动与支持作用参与细胞间的信息传递其他生物学功能：营养蛋白、结构、毒蛋白第一节蛋白质的分子组成和分类一、氨基酸二、肽三、蛋白质的分类大多数蛋白质含氮量接近于16%蛋白质含量=每克样品中含氮的克数

6.25蛋白质的元素组成存在于自然界的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，大部分属于L-

-氨基酸。其中，脯氨酸属于L-

-亚氨基酸，而甘氨酸则属于D--氨基酸。一、蛋白质结构单位-氨基酸人体必需的8种氨基酸氨基酸名称缩写符号（三字）苏氨酸Thr赖氨酸Lsy缬氨酸Val亮氨酸Leu异亮氨酸Ile苯丙氨酸Phe蛋氨酸（甲硫氨酸）Met色氨酸Trp

苏缬亮异亮苯色属芳香缺少赖与蛋人类就遭殃人体必需8种氨基酸的速记口诀L-

-氨基酸的结构通式COOHNH2C

HRHCOO-+NH3C

R不带电形式两性离子形式（一）氨基酸的结构通式COOHNH2C

HRCOO-+NH3C

HH甘氨酸COO-+NH2CH

CH2H2CH2C亚氨基酸-脯基酸-氨基酸的立体异构体非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸（二）氨基酸的分类：非极性疏水性氨基酸2.极性中性氨基酸

3.酸性氨基酸（含两个以上氨基）——His，Arg，Lys；侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷的氨基酸。4.碱性氨基酸（含两个羧基）——Glu，Asp；侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷的氨基酸。物理性质两性解离及等电点紫外吸收显色反应（三）氨基酸的理化性质：1．物理性质

-氨基酸无色晶体，熔点高，味随氨基酸种类不同而不同，能溶于水稀酸稀碱，不溶于有机溶剂+H++OH-pH>pI阴离子+OH-pH=pI兼性离子+H+pH<pI阳离子2．两性解离及等电点等电点（isoelectricpoint,pI）在某一pH环境中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势相等，所带静电荷为零，在电场中不游动，此时氨基酸所处环境的pH值称为该种氨基酸的等电点（pI）。带电状态判定pI-pH<0……………….带负电pI-pH>0……………….带正电pI-pH=0……………….不带电等电点的确定除可用酸碱滴定法测定外，还可用pK值计算。①侧链为非极性基团或虽为极性基团但不解离的AA：pI=1/2（pK1+pK2）②酸性AA（谷、天冬）半胱:pI=1/2（pK1+pKR）③碱性AA（赖、精、组）：pI=1/2（pK2+pKR）天然蛋白质分子的20种氨基酸，以色氨酸和酪氨酸对紫外光有较强的吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最强。可利用此性质用紫外分光光度法测蛋白质的含量。3．紫外吸收性质：氨基酸可与茚三酮缩合产生蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm，吸收峰值与氨基酸含量成正比，可定量分析。例外：脯氨酸黄色，天门冬酰胺棕色4．显色反应：茚三酮反应：2，4-二硝基氟苯(DNFB)反应：氨基酸的α-氨基很容易DNFB作用，生成黄色的2，4-二硝基苯氨基酸（DNP-氨基酸），当DNP-多肽或DNP-蛋白质，经酸水解，只有DNP基仍连在N端氨基酸上，生成DNP-氨基酸，经过醚提和纸层析，可鉴定N端氨基酸的种类和数目。异硫氰酸苯酯（PITC）反应：弱碱条件下，氨基酸的α-氨基很容易与PITC作用，生成PTC-氨基酸，在水酸中PTC-氨基酸即环化为PTH，PTH在酸中稳定。蛋白质的N端氨基酸的α-氨基可与PITC反应，生成PTC-蛋白质，在酸性溶液中它就释放出末端PTH-氨基酸和少一个氨基酸的多肽链，所得的PTH-氨基酸经过乙酸乙酯提取和纸层析，可鉴定氨基酸的种类。*肽键(peptidebond)：是由一个氨基酸的

-羧基与另一个氨基酸的

-氨基脱水缩合而形成的化学键。二、肽(peptide)CHCHOH2NHO+CHCHOHHNHO-HOH甘氨酸甘氨酸甘氨酰酸甘氨酸肽键CHCHO2NHCHCHOHHNO两氨基酸单位之间的酰胺键，称为肽键。多肽链多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基。多肽链具有方向性，头端为氨基端（N端），尾端为羧基端（C端）。

多肽链NC多肽链的形成及其方向性蛋白质与多肽的区别：氨基酸残基数目稳定的空间结构＞50——蛋白质＜50——多肽不稳定的空间结构——多肽稳定的空间结构——蛋白质生物活性肽生物体内具有一定生物学活性的肽类物质称生物活性肽。重要的生物活性肽有谷胱甘肽、神经肽、肽类激素等。

谷胱甘肽是一种称为

-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸的三肽化合物。1．谷胱甘肽（glutathione,GSH）：还原型与氧化型谷胱甘肽的相互转变Glu-Cys-Gly|S|S|Glu-Cys-Gly-2H+2H谷胱甘肽分子中的巯基可氧化或还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。2×Glu-Cys-Gly|

SH解毒作用参与氧化还原反应保护巯基酶的活性维持红细胞膜结构的稳定谷胱甘肽的生理功用种类较多，生理功能各异。多肽类激素主要见于下丘脑及垂体分泌的激素，如催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质激素（39肽）、促甲状腺素释放激素（3肽）。神经肽主要与神经信号转导作用相关，包括脑啡肽（5肽）、

-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）等。2．多肽类激素及神经肽*根据蛋白质组成成分

简单蛋白质:单纯蛋白，仅由氨基酸组成结合蛋白质=蛋白质部分+非蛋白质部分*根据蛋白质形状

纤维状蛋白质球状蛋白质膜蛋白质三、蛋白质的分类简

单

蛋

白清蛋白和球蛋白albuminandglobulin广泛存在于动物组织谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/碱精蛋白和组蛋白碱性蛋白存在于细胞核硬蛋白

结

合

蛋

白色蛋白：简单蛋白+色素物质糖蛋白：简单蛋白+糖类物质脂蛋白：简单蛋白+脂类结合核蛋白：简单蛋白+核酸磷蛋白：简单蛋白+磷酸第二节蛋白质的分子结构一、蛋白质的一级结构

二、蛋白质的空间结构

（一）蛋白质分子中的非共价键

（二）蛋白质的二级结构

（三）蛋白质的三级结构

（四）蛋白质的四级结构蛋白质构象和结构的组织层次蛋白质的结构层次一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构高级结构空间构象定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。主要化学键：肽键

二硫键的位置属于一级结构研究范畴。一、蛋白质的一级结构牛胰岛素的一级结构一级结构测定的原则定义：测定蛋白质中氨基酸的组成蛋白质的N端和C端的测定用两种或两种以上不同水解方法将所要测定的蛋白质肽链断裂分离提纯所产生的肽，并测定它们的序列从重叠结构的各个肽的序列中推断出蛋白质中全部的氨基酸排列顺序。例：某蛋白质肽链的一个片段十肽，用两种方法进行水解肽顺序A1AlaPheB1AlaPheGlyLysA2

GlyLysAsnTyrB2

AsnTyrArgA3

ArgTyrB3

TyrHisValA4

HisVal十肽顺序AlaPheGlyLysAsnTyrArgTyrHisVal除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构都属于空间结构，即构象（conformation）。构象是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。蛋白质的构象通常由非共价键（次级键）来维系。二、蛋白质的空间结构(一)蛋白质分子中的非共价键氢键（hydrogenbond）的形成常见于连接在一电负性很强的原子上的氢原子，与另一电负性很强的原子之间，如>C=O┅┅H-N<。1.氢键：蛋白质分子中氢键的形成H在蛋白质分子中，由于存在数目众多的氢键，故氢键在稳定蛋白质的空间结构上起着重要的作用。但氢键的键能较低(~12kJ/mol)，易被破坏。

非极性物质在含水的极性环境中存在时，会产生一种相互聚集的力，这种力称为疏水键或疏水作用力2.疏水键：蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也是非极性的，这些非极性的基团在水中也可相互聚集，形成疏水键，如Leu，Ile，Val，Phe，Ala等的侧链基团。离子键，又称为盐键（saltbond）是由带正电荷基团与带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离子键。

3.离子键：蛋白质分子中离子键的形成原子之间存在的相互作用力。4．范德华氏引力维系蛋白质分子构象的非共价键蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。定义：稳定因素：

氢键

（二）蛋白质的二级结构1.肽平面(peptideunit)

参与组成肽键的6个原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽键平面。它是蛋白质构象的基本结构单位。HHHH

-螺旋(

-helix)

-折叠(

-pleatedsheet)

-转角(

-turn)

无规卷曲(randomcoil)

2.蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋-天然蛋白质结构要点:

①多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧，键内形成氢键。②每圈螺旋含3.6个氨基酸，螺距为0.54nm。③每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定。氢键与螺旋长轴基本平行。非典型的

-螺旋

表示形式：ns螺旋上升一圈的氨基酸残基数氢键间的原子数典型表示形式：3.613非典型：3.010、4.410⑴极大的侧链基团（存在空间位阻）；⑵连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基（同种电荷的互斥效应）；⑶有Pro等亚氨基酸存在（不能形成氢键）。影响

-螺旋稳定的因素

-折叠①多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。②两段以上的β-折叠结构平行排列，两链间可顺向平行，也可反向平行。③两链间的肽键之间形成氢键，以稳固β-折叠结构。氢键与螺旋长轴垂直。

-折叠的平行式与反平行式排列平行式反平行式

-折叠

-转角①肽链内形成180º回折。②含4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基的羟基与第四氨基酸残基的氢个形成氢键。③第二个氨基酸残基常为Pro。

-转角：无规卷曲是指多肽链主链部分形成的没有一定规律的松散结构。对于特定的蛋白质分子而言，其无规卷曲部分的构象则是特异的。无规卷曲核糖核酸酶分子中的二级结构α-螺旋β-折叠β-转角无规卷曲蛋白质的超二级结构和结构域超二级结构：指若干相邻二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成的有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。超二级结构几种超二级结构βαββ×βαα连接链结构域：多肽链在超二级结构基础上进一步的弯折折叠成一些在功能上相对独立的，结构较为紧凑的近似球状的结构。结构域（domain）（三）蛋白质的三级结构多肽链首先在某些区域形成二级结构，然后相邻的二级结构集成超二级结构，进而折叠绕曲成结构域，有两个或两个以上的结构域组装成三级结构。蛋白质的三级结构(tertiarystructure)：是指多肽链上的所有原子（包括主链和残基侧链）在三维空间的分布。胰岛素分子的三级结构溶菌酶分子的三级结构磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构纤连蛋白(fibronectin)分子的结构域（四）蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构（quaternarystructure）就是指蛋白质分子中亚基的立体排布，亚基间的相互作用与接触部位的布局。就是指参与构成蛋白质四级结构的、每条具有三级结构的多肽链。亚基（subunit）亚基的立体排布方式血红蛋白(hemoglobin)的四级结构蛋白质分子的结构层次第三节蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系

二、蛋白质空间结构与功能的关系

蛋白质一级结构是空间结构和生物功能的基础。一级结构决定空间结构，一级结构并非决定空间结构的唯一因素。空间结构是生物活性的直观体现。一、蛋白质一级结构与功能的关系

1、决定空间结构2、同源蛋白质的物种差异与生物进化3、一级结构上的细微变化可直接影响其功能牛核糖核酸酶的一级结构二硫键1、蛋白质一级结构—决定空间结构天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性核糖核酸酶结论：核糖核酸酶肽链上的一维信息控制肽链自身折叠所形成的特定构象，并由此确定了Cys残基两两相互接近的正确位置，也就是说一级结构决定其高级结构。2、同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质：在不同物种中具有同种或相似功能的蛋白质。序列同源（性）：同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性。不变残基：同源蛋白质的氨基酸序列，有些位置的氨基酸残基对所有物种来说都是相同的，这些氨基酸残基被称为不变残基。可变残基：其他位置的氨基酸残基在不同物种间差异很大，这些氨基酸残基被称为可变残基。细胞色素C脊椎动物的细胞色素C黄色：不变残基（28）结论：同源蛋白质序列的氨基酸差异数目与物种间的系统发生差异是成比例的，亲缘关系越近，其氨基酸序列之间的差别越小。3、一级结构上的细微变化可直接影响其功能胰岛素分子病

B链Phe24Leu活性降低膀胱癌P21蛋白Gly12Val分子病：由于遗传基因的突变导致了蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序与正常有所不同的遗传病。例：镰刀形红细胞贫血病

PaulingHbA和HbS的等电点血红蛋白HbA的等电点HbS的等电点差值氧合Hb6.877.090.22脱氧Hb6.686.910.23HbSβ肽链N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Glu·Glu·····C(146)HbAβ肽链N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Val

·Glu·····C(146)1954Ingran指纹图谱分析α链完全相同α链完全相同二、蛋白质空间结构与功能的关系

1、肌红蛋白与血红蛋白的结构2、氧结合引起血红蛋白构象的变化3、蛋白质构象变化对功能的影响1、肌红蛋白与血红蛋白的结构

血红蛋白是四聚体，每个亚基含一个血红素辅基。血红素中的二价铁原子能与氧可逆结合，并保持铁的价数不变。

Hb与Mb均能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。2、血红蛋白的构象变化与结合氧肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线*协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。促进作用称为正协同效应(positivecooperativity)抑制作用称为负协同效应(negativecooperativity)变构效应(allostericeffect)凡蛋白质（或亚基）因与某小分子物质相互作用而发生构象变化，导致蛋白质（或亚基）功能的变化，称为蛋白质的变构效应。3、蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化一、蛋白质的相对分子质量

二、蛋白质的两性解离与等电点

三、蛋白质的胶体性质

四、蛋白质的沉淀

五、蛋白质的变性

六、蛋白质的颜色反应

七、蛋白质分离纯化

八、多肽链中氨基酸序列分析一、蛋白质的相对分子质量蛋白质的分子量一般在一万至一百万道尔顿之间1道尔顿＝1×C12绝对质量/12≈1.66×10-27千克（一）根据化学组成测定最小分子量测定蛋白质中某一微量元素的含量例：假设蛋白质中仅含一个铁原子最低相对分子质量=100×55.8/铁的百分含量（二）渗透压法测定相对分子质量

在理想溶液中，渗透压是浓度的线性函数，而与溶质的形状无关。所以可用渗透压计算蛋白质的分子量。当蛋白质浓度不大时，可用下式计算：M=RT/lim(Π/C)

利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。沉降系数：单位离心场里的沉降速度，用S表示。一个S单位=1×10-13

S8×10-13

S的沉降系数用8S表示。（三）离心法测定相对分子质量（四）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定相对分子质量原理：蛋白质电泳时的迁移率与其所带净电荷、分子大小和形状有关，加入SDS后，每克蛋白可结合1.4克SDS，将原有电荷掩盖，而且使分子变成棒状。由于凝胶的分子筛效应，相对迁移率μR与分子量有如下关系：lgM=K1－K2μR十二烷基磺酸钠SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键（五）凝胶过滤法测定相对分子质量原理：层析柱中填充凝胶颗粒，凝胶的网格大小可通过交联剂含量控制。小分子物质可进入网格中，流出慢；大分子被排阻在颗粒外，流经距离短，流出快。计算公式：lgM＝K1－K2Ve

其中：Ve-是洗脱体积，即从加样到出峰时流出的体积，K1和K2是常数，随实验条件而定。蛋白质混合样凝胶法只适于球状蛋白分子测量二、蛋白质的两性解离与等电点由于蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的氨基和游离的羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质，因而也具有特定的等电点（pI）。当溶液pH＝pI时，蛋白质正负电荷相等；当溶液pH＞pI时，蛋白质带净负电荷；当溶液pH＜pI时，蛋白质带净正电荷。电泳技术带电胶体颗粒在电场中可以向电荷相反方向，由于蛋白质在溶液中可以解离成带电的粒子，因此在电场中可以移动，这种大分子化合物在电场中移动的现象称为电泳（electrophoresis）

。蛋白质颗粒电泳时迁移率影响因素：所带电荷分子量分子形状几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳*等电聚焦电泳*免疫电泳凝胶电泳纸电泳自由界面电泳区带电泳平板电泳圆盘电泳纸电泳操作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳三、蛋白质的胶体性质蛋白质分子的颗粒直径已达1~100nm，处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。蛋白质溶液具有胶体的特征：丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质蛋白质胶体溶液的稳定因素：1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥2.水膜弹性蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用；透析*透析(dialysis)：利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮纸、火胶棉、玻璃纸等来分离