第20章 高效液相色谱

第20章高效液相色谱法本章学习要点高效液相色谱法的特点高效液相色谱仪基本构造液相色谱固定相及分离原理液相色谱流动相的选择作业：20-1;20-2;20-4;20-7;20-10第20章高效液相色谱法20-1概述20-2高效液相色谱仪20-4液固色谱20-5化学键合相色谱20-6离子交换色谱与离子色谱20-7离子对色谱20-8尺寸排阻色谱20-9超临界流体色谱简介*20-1概述一、高效液相色谱的特点二、高效液相色谱的分类一、高效液相色谱的特点(1)高效液相色谱与气相色谱的比较分析对象流动相色谱柱温度分析对象气相色谱：气体和沸点较低的化合物，

占有机物总数20%高效液相色谱：高沸点、热稳定性差、分子量大的物质，

占有机物总数80%流动相气相色谱流动相：对组分没有亲和力的惰性气体，对分离选择性几乎无影响高效液相色谱流动相：可选用不同极性的液体选择余地大对分离影响大（与组分或固定相均作用）色谱柱温气相色谱柱温：一般较高高效液相色谱柱温：通常为室温一、高效液相色谱的特点(2)高压：150-350105Pa高速：一般<1h,<1min.高效：柱效高高灵敏度：10-9g(紫外检测器）

10-12g（荧光检测器）WatersUPLC–超高效液相色谱高灵敏度高分辨率高速度压力高达15,000psi填料颗粒度1.7µm……超高效液相色谱遵循范德米特方程小颗粒度填料提高分离度

3D图谱比较HPLCUPLCRatUrine一、高效液相色谱的特点(3)方法的局限性成本高、环境污染、梯度洗脱操作复杂。缺少灵敏度高的通用型检测器复杂样品分离，缺少总理论塔板数达数十万的色谱柱。受压易分解或变性的生物样品局限1成本高、环境污染、梯度洗脱操作复杂。Solution:微型化（毛细管色谱柱）、水为流动相等Nanoborecolumn(0.025mmi.d.0.1mm)ChipcolumncoupledtoMS

ZORBAX300SBC185µmparticlesH.-F.Yinetal.,presentedatthe18thInternationalSymposiumonMicroscaleSeparationsandAnalysis,HPCE,SanDiego,January2003.Separationofpeptidesonchipcolumn局限2缺少灵敏度高的通用型检测器Solution:蒸发光散射检测器

Corona电雾式检测器（ChargedAerosolDetector，CAD）局限3复杂样品分离，缺少总理论塔板数达数十万的色谱柱。Solution:UPLC(UHPLC)Thesamplewasrunusingconstant-flowpumpsat52000psiona38cmlongcapillarypackedwith1.0µmC18particles.二、高效液相色谱的分类按分离原理分类：分配色谱吸附色谱离子交换色谱尺寸排阻色谱疏水作用色谱二、高效液相色谱的分类按分离规模分类：制备色谱柱内径>10mm半制备色谱柱内径>5-10mm分析型色谱柱内径<5mm21-2高效液相色谱仪高效液相色谱仪的结构高效液相色谱仪的主要部件20-2高效液相色谱仪一、高效液相色谱仪的结构二、高效液相色谱仪的主要部件高压输液系统进样系统分离系统检测系统附属系统(一）高压输液系统储液罐高压输液泵过滤器压力脉动阻尼器1.储液罐必须有足够的容积与溶剂不发生化学反应便于对溶剂进行脱气不锈钢、玻璃、氟材料容积：500-2000cm3溶剂的过滤与脱气过滤：除去溶剂中的固体微粒脱气：除去溶剂中溶解的气体过滤过滤脱气加热法抽真空吹氦气超声波在线脱气超声波清洗器2.高压输液泵对泵性能的要求输出压力高150-300kg/cm2500kg/cm2流量范围广0.1--10cm3/min

可调流量稳定无脉动，流量精度0.5%左右耐腐蚀适用于各种有机溶剂、水、缓冲溶液往复泵单泵与双泵脉动阻尼器过滤器烧结不锈钢材料制成孔径：2-10m（二）进样系统取样和进样功能手动和自动要求：密封性好死体积小重复性好进样时对色谱系统的压力和流量波动小进样1进样2进样3自动进样器(三)分离系统色谱柱柱箱*色谱柱柱材料：不锈钢柱长度：5-30cm柱内径：2-5mm填料：3-10m填充：匀浆法高效液相色谱柱高效液相色谱柱匀浆法装柱示意图匀浆法装柱示意图高效液相色谱填料填料热力学特性影响色谱柱的选择性填料的动力学性质或结构特点影响色谱柱的效率颗粒的大小、形状、均匀性、比表面积孔径、孔体积等。高效液相色谱填料（物理形态）全多孔型（porousparticle)球形不规则形无孔小粒径型(non-poroussmallparticle)表面多孔型(porouslayerbeads)贯流型粒子(flow-throughparticle)贯穿孔(throughpores,600-800nm)扩散孔(diffusepores,50-150nm)连续床(整体柱）(monolithicstationaryphase)全多孔型（porousparticle)孔的类型微孔孔径<2nm中孔孔径<50nm,>2nm大孔孔径>50nm使用中孔和大孔填料微孔易造成色谱峰拖尾表面多孔型(porouslayerbeads)贯流型粒子(flow-throughparticle)颐和园整体柱材料

高效液相色谱填料的基质无机基质材料硅胶(silica)、氧化铝、氧化锆、氧化钛、羟基磷灰石、多孔玻璃、多孔石墨碳等有机基质材料：天然多糖凝胶（如葡聚糖系、琼脂糖系等）高聚物树脂（如交联苯乙烯树脂、交联聚甲基丙烯酸酯类树脂等）色谱用硅胶基质材料硅胶的表面硅胶的化学稳定性硅胶的物理性质多孔硅胶的制备多孔硅胶的表面改性（1）硅胶的表面暴露于表面的Si-O-Si（疏水）硅羟基Si-OH吸附水硅胶表面的硅羟基硅羟基浓度：8.0±0.1

mol/m2吸附水(2)硅胶的化学稳定性一般可以耐受酸性介质的侵蚀在纯水中的平衡溶解度100mg/LpH>9时溶解度显著增加溶解度与粒径有关（3）硅胶的物理性质颗粒的形状与大小孔径大小及其分布微孔<2nm;中孔(2-50nm);大孔>50nm比孔容(mL/g)比表面积机械强度(4)多孔硅胶的制备两相法喷雾干燥法堆积硅珠法生物微囊法改进两相法制得硅胶武汉大学国外知名品牌大孔球形硅胶（5）多孔硅胶的表面改性与修饰表面化学修饰整体改性聚合物包覆法表面化学修饰硅烷化试剂与硅羟基反应硅烷化试剂氯硅烷烷氧基硅烷(四）检测系统---检测器理想检测器应具有的特点：灵敏度高对所有的样品都有响应对温度和流速波动不敏感死体积小对样品无破坏性对溶剂无响应，能用于梯度洗脱线性范围宽重现性好、响应时间快能给出定性信息溶质性质检测器：对被分离组分的物理或化学特性有响应紫外、荧光、电化学检测器等总体检测器：对试样和流动相总的物理或化学性质有响应示差折光检测器、电导检测器等检测器的分类几种常用检测器简介紫外光度检测器(ultravioletphotometricdetector)光电二极管阵列检测器(photo-diodearraydetector)荧光检测器(fluorescencedetector)示差折光检测器(differentialrefractiveindexdetector)蒸发光散射检测器（evaporativelightscatteringdetector)电导检测器(electricalconductivitydetector)(1)紫外光度检测器应用最广泛的一种高效液相色谱检测器约80%的样品固定波长可变波长紫外光度检测器光路图紫外光度检测器光路图(2)光电二极管阵列检测器三维色谱-光谱图光电二极管阵列检测器的主要特点可获得三维色谱-光谱图的检测器三维色谱-光谱图：时间-波长-吸收值波长范围：190-950nm可同时获得不同波长条件下的色谱图可利用色谱保留值及光谱特征吸收曲线定性可判别色谱峰的纯度及分离状态(3)荧光检测器利用某些试样具有荧光特性建立的检测方法高灵敏度和高选择性（检出限10-12-10-13g/cm3)稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等荧光物质。荧光检测器光路图(4)示差折光检测器连续测定流出液折光指数的变化通用型检测器，但灵敏度较低（10-7g/cm3)反射式示差折光检测器偏转式示差折光检测器干涉式示差折光检测器偏转式示差折光检测器光路图示差折光检测器使用要点流动相组成要恒定（变化值<10-6）温度恒定（样品池与参比池的温差±10-4C)压力恒定（检测池不耐压）流速稳定（流量波动<5%）不可用于梯度洗脱（5）蒸发光散射检测器通用型检测器不需要衍生便可检测任何不带发色基团的化合物比示差折光检测器更佳的灵敏度及稳定性对温度变化不敏感可用于梯度洗脱响应值与样品质量有关，对所有样品的检测给出近乎一样的响应因子测定物质的纯度和定量测定未知物蒸发光散射检测器(ELSD)蒸发光散射检测器工作原理ELSD和RI的基线稳定性及灵敏度比较应用例1应用例2应用例3电雾式检测器ChargedAerosolDetector，CAD(6)电导检测器基于物质在某些介质中电离后所产生电导变化进行测定的检测器主要应用于离子色谱受温度影响较大电导检测器结构示意图(7)联用技术HPLC-MSHPLC-NMRHPLC-FTIRUPLC-SQDHTCUltraAgilent6210LC-TOFMSLC-MSQuatroPremier(Q-Q-Q)QTofPremier

Q-Trap(Q-Q-LT)LC-MS(多级质譜串联)APCIAPPIapplication(8)梯度淋洗装置低压梯度高压梯度高效液相色谱的主要类型液固色谱化学键合相色谱离子交换色谱与离子色谱离子对色谱尺寸排阻色谱亲和色谱20-4液固色谱（吸附色谱）固定相保留机理流动相及其选择应用例一、固定相液固色谱的固定相-固体吸附剂常用：硅胶和氧化铝其它：氧化锆、氧化钛、氧化镁、分子筛、聚酰胺、活性炭等等硅胶是最重要的液固色谱的固定相硅胶的表面结构与性质二、保留机理液-固色谱采用极性固体吸附剂如硅胶等作为固定相。根据流动相的极性不同，在固体吸附剂表面形成单分子或双分子层溶剂分子吸附层。当样品分子进入色谱体系，溶质保留和分离选择性决定于：溶质分子和溶剂分子与吸附剂表面活性点的竞争。流动相对样品的溶解能力。溶质分子的各种官能团与吸附剂表面活性点的分子间相互作用。二、保留机理硅胶的吸附中心极性相互作用对试样的保留顺序选择性硅胶的吸附中心硅胶的吸附中心硅羟基与样品组分相互作用偶极-诱导偶极偶极-偶极氢键-络合物（孤对电子、双键）极性相互作用选择性有利于异构体的分离三、流动相及其选择溶剂强度单一溶剂混合溶剂溶剂的选择性流动相选择规则溶剂强度Snyder提出的溶剂强度参数

0混合溶剂的强度溶剂的选择性流动相的选择规则“B浓度规则”(“B-concentrationrule”)薄层色谱B浓度规则弱强度溶剂A+强溶剂B=流动相改变强溶剂B浓度，优化容量因子为提高选择性，在等强度条件下，选择其它具有不同选择性的B溶剂，直到获得最佳流动相组成。四、应用例吸附色谱的优势：异构体分离例1例2例320-5化学键合相色谱采用化学键合相作为固定相的液相色谱称化学键合相色谱法特点：固定相稳定性好适合于梯度洗脱应用范围广化学键合相色谱键合固定相类型键合固定相的制备反相键合相色谱法正相键合相色谱法一、键合固定相类型键合固定相的基质材料主要为硅胶（1）疏水基团

不同链长的烷烃（C8,C18）和苯基等（2）极性基团氨丙基、腈乙基、醇和醚等（3）其它基团

离子交换基、手性识别基、配基（如酶、抗原、激素等）二、键合固定相的制备（1）硅酸酯二、键合固定相的制备（2）Si-C和Si-N型二、键合固定相的制备（3）硅烷化三、反相键合相色谱法流动相极性大于固定相的色谱法固定相保留机理溶剂强度溶剂选择性流动相及其选择应用例（1）固定相最常用的固定相：C18(ODS:chemicallybondedoctadecylsilane)C8和其它短链烷烃、苯基键合硅胶固定相ODS示意图（2）保留机理疏溶剂作用理论试样组分的流出顺序组分流出顺序为：疏水性小者先流出疏水性大者后流出（3）溶剂强度反相液相色谱最常用的溶剂：甲醇(methanol)、乙腈(acetonitril)、四氢呋喃(tetrahydrofuran)、水（缓冲溶液）用极性参数P表示极性大，强度弱；极性小，强度强（为什么？）Pmethanol5.1Pacetonitril5.8Ptetrahydrofuran4.0Pwater10.2混合溶剂的强度PAB=

APA+BPB（4）溶剂选择性（5）流动相及其选择反相液相色谱流动相的基本组成：水+有机改性剂（甲醇或乙腈或四氢呋喃）选择：1.用水和甲醇（或乙腈）的混合溶剂为流动相，通过改变混合比优化

k2.等强度更换有机改性剂，提高选择性流动相选择例（6）应用例高尔夫球场杀虫剂的分离梯度四、正相键合相液相色谱法流动相极性小于固定相极性的键合相液相色谱法固定相：含有极性基团的键合相，如-CN,-NH2,-OH流动相：流动相组成与液固色谱相同，但强度用极性参数

P应用：分离异构体、极性不同的化合物、不同类型的化合物非离子表面剂的分离20-6离子交换色谱与离子色谱以离子交换剂为固定相，借助于试样中电离组分对固定在交换剂上的带相反电荷的离解部位亲合力，使其彼此分离。分离对象：离子或在溶液中可电离的物质无机离子混合物有机物：氨基酸、核酸、蛋白质等主要内容离子交换原理固定相流动相应用例离子排斥色谱离子色谱一、离子交换原理离子交换通式阳离子交换R-SO3-H++M+R-SO3-M++H+阴离子交换R-NR3+Cl-+X-R-NR3+X-+Cl-离子交换通式一般形式：R-A+BR-B+A平衡常数（离子交换反应的选择系数）二、固定相离子交换剂基质材料：合成树脂（苯乙烯）、纤维素、硅胶带电基团：阳离子交换剂、阴离子交换剂强阳离子交换剂SCX-SO3H弱阳离子交换剂WCX-CO2H强阴离子交换剂SAX-N+R3弱阴离子交换剂WAX-NH2常用的离子交换剂多孔型离子交换树脂粒径5-20m交换容量高柱效低薄膜型离子交换树脂表面多孔型离子交换树脂柱效高交换容量低离子交换键合固定相机械强度高柱效高理论交换容量：每克干树脂所含离子交换基团的量三、流动相一定pH值和盐浓度的缓冲溶液流动相强度和选择性(k,)盐浓度（离子强度）种类pH(1)流动相中盐浓度的影响盐浓度增加，降低试样组分在固定相上的保留。(2)盐种类的影响阴离子交换：洗脱强度：柠檬酸离子>SO42->C2O42->I->NO3->CrO42->Br->SCN->Cl->HCOO->CH3COO->OH->F-阳离子交换：洗脱强度：Ba2+>Pb2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Co2+>Zn2+>Mg2+>Ag+>Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+

(3)pH的影响强离子交换剂：pH影响弱电解质组分的离解。如有机酸和有机碱弱离子交换剂：pH影响弱电解质组分的离解。如有机酸和有机碱离子交换剂自身的交换容量四、应用例Separationofnucleotidesand

relatedcompoundsbyanionexchange五、离子排斥色谱离子排阻色谱离子排阻分配色谱（ionexclusionpartitionchromatography)离子节制分配色谱（ion-moderatedpartitionchromatography)离子排斥色谱的原理强阳离子交换树脂与有机酸的作用。由于Donnan电位的存在，使强酸阴离子受阻于树脂之外，而低电离度的弱酸分子可进入树脂内部，通过与树脂相互作用得到保留。选择性：组分受阻程度的不同组分与树脂功能基的极性相互作用的差异组分与树脂基体间的非极性相互作用的差异有机酸的分离例六、离子色谱分离原理同离子交换色谱采用低交换容量的固定相低浓度的电解质溶液为流动相检测技术的改进双柱离子色谱1975年Small等提出单柱离子色谱Fritz等提出双柱离子色谱抑制柱中的反应R+-OH-+H+Cl-R+-Cl-+H2OR+-OH-+M+Cl-M+OH-+R+-Cl-单柱离子色谱固定相：低交换容量的离子交换剂流动相：采用电导极低的溶液作为流动相，例如10-4mol/mL的苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐稀溶液。单柱离子色谱法中使用的洗脱液阴离子：苯甲酸盐、氢氧化钠、甲基磺酸盐、邻苯二甲酸盐、柠檬酸盐、水杨酸等阳离子：硝酸、高氯酸、乙二胺硝酸盐、乙二胺硝酸盐等单柱离子色谱法的特点应用范围比双柱法宽灵敏度比双柱法约低一个数量级离子色谱法的应用无机阴、阳离子，有机离子分析的重要手段一种应用广泛的色谱分析方法环境科学、生命科学、食品科学等Separationoforganicacidsandinorganicanionsinwine20-7离子对色谱用正相或反相色谱柱分离离子和中性化合物混合物的色谱方法正相离子色谱；反相离子对色谱1970年代中Schill等人将“离子对萃取”原理引入高效液相色谱，建立了离子对色谱法。与离子交换色谱或离子色谱相比柱效高，分离效果好可同时测定离子型化合物和中性化合物反相离子对色谱的分离过程固定相：一般为烷基键合硅胶固定相，如ODS原理A+(w)+B-(w)A+B-(o)流动相缓冲溶液离子对试剂有机溶剂（甲醇、乙腈）离子对试剂用于酸性化合物分析：季铵盐如四甲基铵、四丁基铵叔胺如三辛胺、三庚胺用于碱性化合物分析：烷基磺酸盐、烷基硫酸盐高氯酸盐尿中儿茶酚胺类化合物的分析1.去甲肾上腺素2.肾上腺素3.多巴胺IS:3,4-二羟基苯甲胺固定相：C8流动相：含辛基硫酸钠的缓冲溶液+甲醇血浆中-酮酸类化合物的分析固定相：C8流动相：含溴化四丙基铵的磷酸盐缓冲液+ACN20