第14章-维生素类药物的分析

维生素类药物的分析第十四章维生素FrederickGowlandHopkin

ChristiaanEijkman

1929NobelPrizeGeorgeWald

1967NobelPrize教学目标掌握维生素A与维生素B1的结构、性质及鉴别试验；熟悉紫外三点校正法测定维生素A含量的原理及计算；分类

VitA、D2、D3、E、K1

等

脂溶性水溶性

VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、叶酸、烟酸、泛酸等。按溶解度分维生素A结构-H维生素A醇-COCH3维生素A醋酸酯-COC15H31维生素A棕榈酸酯R:结构VitA2VitA3结构鲸醇结构与性质溶解性紫外吸收不稳定性与三氯化锑反应325~328nm结构与性质

△或有金属离子存在时氧化↑共轭多烯侧链：易被氧化环氧化物VitA醛VitA酸结构与性质鉴别试验三氯化锑反应(Carr-Price反应)条件：无水无醇CHCl3紫红蓝色®¾¾¾®¾3SbClVitA鉴别试验鉴别试验维生素AChP（2010）[鉴别]取本品1滴，加三氯甲烷10ml振摇使溶解；取2滴，加三氯甲烷2ml与25%三氯化锑的三氯甲烷溶液0.5ml，即显蓝色，渐变成紫红色。三氯化锑反应鉴别试验（BP（2000））UV法λmax为326nm一个吸收峰λmax为350～390nm三个吸收峰鉴别试验鉴别试验USP显色剂磷钼酸规定斑点颜色和Rf值BP

对照品法显色剂三氯化锑TLC法含量测定立体异构体氧化降解产物合成中间体UV法(三点校正法)维生素A2维生素A3环氧化物维生素A醛维生素A酸含量测定维生素A的含量用生物效价即国际单位（IU/g）来表示。规定：效价1IU=0.344µg

全反式维生素A醋酸酯1IU=0.300µg

全反式维生素A醇每1g全反式维生素A醋酸酯/醇相当于多少国际单位？含量测定换算因子意义：单位E数值所相当的效价。%1cm含量测定含量测定含量测定三点校正法（法定方法）1.原理：（1）杂质的吸收在310-340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；（2）物质对光的吸收具有加和性。含量测定2.波长的选择：（1）

1

VitA的

max（328nm或325nm）（2）

2

3

分别在

1的两侧各选一点含量测定测定对象：VitA醋酸酯=12nm测定对象：VitA醇

1=325nm,2=310nm,3=334nm第一法:等波长差法第二法:等吸收比法含量测定测定法（1）基本步骤:第一步A的选择选择依据：所选A值中杂质的干扰已基本消除。含量测定第二步求注意：

C为混合样品的浓度

第三步求效价含量测定第四步：求标示量％含量测定

方法：（2）

第一法维生素A醋酸酯含量测定

判断

是否在326～329nm之间在326～329nm之间改用第二法是否

求算

并与规定值比较含量测定

规定值差值

判断差值是否超过规定值的有一个以上超过无超过

计算

A328（校正）

用A328计算含量测定含量测定03%－15%－3%第二法第二法含量测定含量测定适用于维生素A醇（等吸收比法）

第一法无法消除杂质干扰时用此法[皂化法、6/7A法]（3）第二法含量测定水溶性脂溶性含量测定

判断

max是否在323～327nm之间取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定

计算是否含量测定

判断A300/A325

是否大于0.73是否取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定

计算A325(校正)含量测定含量测定03%－3%含量测定

VitAD胶丸中VitA的含量测定精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物0.1287g至10ml烧杯中，加环己烷溶解并定量转移至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为含量测定A300：0.374A316

：0.592A328：0.663A340：0.553A360：0.228A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.344

求本品中维生素A占标示量的百分含量？A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.344

0.5550.9071.0000.8110.299

+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)=3.52(2×0.663–0.592–0.553)=0.637含量测定A328(校正)–A328(实测)A328(实测)×100=0.637–0.6630.663×100=-3.92E1%1cm(328nm)=A328(校正)100ms/D=0.637100×0.1287/1250=61.87含量测定供试品中维生素A效价=

E1%1cm(328nm)×1900=61.87×1900=117553（IU/g）标示量%=VA效价(IU/g)×每丸内容物平均装量(g/丸)标示量(IU/丸)×100%=117553×0.0798510000×100%=93.9%含量测定含量测定三氯化锑比色法：优点：简便、快速λmax618nm～620nm标准曲线法缺点呈色不稳定（5～10s内）水分干扰与标准曲线温差≤1℃专属性差三氯化锑有腐蚀性蓝色+3SbClVitA氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵碱)HClCl-结构维生素B1（硫胺）12345615432结构与性质溶解性紫外吸收硫色素反应氯化物、硫元素λmax=246nm与生物碱沉淀剂反应鉴别试验维生素B1ChP（2010）[鉴别]

(1)取本品约5mg，加氢氧化钠试液2.5ml溶解后，加铁氰化钾试液0.5ml与正丁醇5ml，强力振摇2分钟，放置使分层，上面的醇层显强烈的蓝色荧光；加酸使成酸性，荧光即消失；再加碱使成碱性，荧光又显出。硫色素荧光反应硫色素O环合-2H鉴别试验生物碱沉淀剂反应VitB1K2HgI4黄色I2-KI红色硅钨酸白色苦酮酸白色扇形鉴别试验氯化物反应(Chp2010)硫元素反应含量测定电位滴定法（一）非水减量法反应摩尔比为1：2含量测定（二）UV含量测定含量测定片剂、注射剂=421（每片）相当于标示量的%=A=ECL规格g/片gChP2010WEA%cmD10011××%100标示量平均片重××含量测定（每ml）相当于标示量的%=规格g/mlml%VEA%cm100110011×标示量稀释倍数××含量测定原理荧光硫色素异丁醇铁氰化钾1VitBNaOH（三）硫色素荧光法USP含量测定方法（三）硫色素荧光法USP配氧化试剂、对照品、供试品溶液测定对照品供试品空白计算特点（1）灵敏度高，线性范围宽（2）代谢产物不干扰，适用于体液分析含量测定结构L－抗坏血酸维生素C结构与性质1、易溶于水2、水溶液呈酸性溶解性结构与性质C3－OH的pKa=4.17C2－OH的pKa=11.57一元酸酸性结构与性质二烯醇结构二酮基结构二烯醇结构还原性结构与性质有活性有活性无活性结构与性质△糖类的显色反应50℃结构与糖类相似具有糖的性质结构与性质L(+)－抗坏血酸活性最强手性C（C4、C5）**光学活性结构与性质与碱反应水解性结构与性质鉴别试验去氢抗坏血酸]O[VitC与氧化剂的反应鉴别试验1、与AgNO3反应2、与2，6-二氯靛酚反应(ChP2010)氧化型玫瑰红色还原型蓝色OHˉ(ChP2010)（玫瑰色）（无色）鉴别试验3.其他氧化剂的反应：亚甲蓝或高锰酸钾试剂褪色

碱性酒石酸铜砖红色沉淀

磷钼酸钼蓝

鉴别试验或盐酸50℃吡咯USP鉴别试验糖类的反应鉴别试验（蓝色）(糠醛)（戊糖）50℃(吡咯)BP0.01mol/LHCl鉴别试验UV薄层色谱法Chp2010VitC制剂1.溶液的澄清度与颜色：有色杂质分光光度法

2.铁、铜离子：原子吸收分光光度法3.草酸：比浊杂质检查含量测定指示剂淀粉指示液碘量法原理含量测定H+含量测定

取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6。方法含量测定（1）酸性环境（2）新沸冷H2O减慢VitC被O2氧化速度（3）立即滴定

赶走水中O2减少O2的干扰方法（4）附加剂干扰的排除片剂——滑石粉——过滤注射剂——抗氧剂——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5含量测定CHHOOaS3aSO+H2NHON2252HONHCOS3a含量测定USPJP酚亚胺二氯靛酚，-62VitC含量测定2,6-二氯靛酚钠滴定法原理自身指示终点法含量测定方法（2）快速滴定2min内（1）酸性环境HPO3-HAc稳定VitC防止其他还原性物质干扰（3）剩余比色测定（定量过量）（测剩余染料）含量测定讨论（4）缺点

需经常标定贮存≤一周不稳定干扰多氧化力较强含量测定苯并－二氢吡喃醇结构维生素E12345678名称R1R2相对活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1***结构dl－α－生育酚醋酸酯结构苯环+二氢吡喃环+饱和烃链1、UV2、乙酰化的酚羟基易水解]O[醌型化合物△生育酚-+orOHHVitE杂质，需检查结构与性质鉴别试验]O[生育红硝酸反应橙红色75℃15′HNO3VitE生育酚（橙红色）生育红生育酚HNO3鉴别试验强氧化剂鉴别试验三氯化铁－联吡啶反应生育酚对-生育醌[O]弱氧化剂鉴别试验血红色鉴别试验

=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%无水乙醇中UV鉴别试验薄层板硅胶G展开剂环己烷-乙醚（4：1）显色剂硫酸（105℃5′）VitERf

=0.7-生育酚Rf

=0.5-生育醌Rf

=0.9鉴别试验薄层色谱法游离生育酚

原理酸度以NaOH滴定液（0.1mol/L）体积控制。杂质检查（M生育酚=430.8）

取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过1.0ml。例杂质检查≤2.15％限量杂质检查GC法（法定方法）GC特点选择性好灵敏度高速度快分离效能好挥发性低、不稳定、极性强→衍生化易受样品蒸气压限制含量测定载气→N2固定液→硅酮（OV-17）担体→硅藻土或高分子多孔小球柱温→265℃检测器→氢火焰离子化检测器(FID)内标→正三十二烷

n≥500R≥2内标法加校正因子色谱条件含量测定内标法供试液（样品+内标）内标物对照液（对照+内标）是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近能与各组分完全分离与被测组分的量接近含量测定HPLC法

外标法此外，还有铈量法、比色法和荧光法含量测定维生素D2(麦角骨化醇)结构维生素D12345678910111213141516171819202122232425262728结构维生素D维生素D3（骨化醇）123456789101112131415161718192021222324252627开环的甾体：具有甾类化合物的显色反应，可用于鉴别。手性碳原子：具有旋光性，可用于鉴别。多烯：不稳定性、紫外吸收。结构与性质显色反应醋酐--硫酸反应D2

黄红紫绿

D3

黄红紫、蓝绿绿三氯化锑反应橙红色渐变粉红三氯化铁反应橙黄色二氯丙醇和乙酰氯反应绿色鉴别试验比旋度鉴别维生素D2维生素D3溶剂

浓度

比旋度值无水乙醇无水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5°～+107.5°+105°～+112°注意事项：应于容器开启30分钟内取样，在溶液配制后30分钟内测定。鉴别试验如何区别VitD2

和VitD3鉴别试验96%乙醇溶液乙醇、85%硫酸红色λmax＝570nm黄色λmax＝495nmVitD2VitD3鉴别试验[鉴别](1)取本品约0.5mg，加三氯甲烷5ml溶解后，加醋酐0.3ml与硫酸0.1ml，振摇，初显黄色，渐变红色，迅即变为紫色，最后成绿色。

(2)在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。(3)本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱（光谱集452图）一致。维生素D2

ChP(2010)鉴别试验[鉴别](1)取本品约0.5mg，加三氯甲烷5ml溶解后，加醋酐0.3ml与硫酸0.1ml，振摇，初显黄色，渐变红色，迅即变为紫色、蓝绿色，最后成绿色。

(2)本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱（光谱集