米渣中谷蛋白的提取、纯化及性质研究

米渣中谷蛋白的提取、纯化及性质研究

随着“牛病”和“口蹄病”等疫情在世界的蔓延，动物蛋白的安全性受到质疑，植物蛋白化的利用变得越来越重要。大米蛋白作为植物蛋白,氨基酸配比平衡合理,具有高生物效价和低过敏性等特点。大米经过高温液化和糖化作用后,蛋白浓缩富集,形成大米浓缩蛋白,俗称米渣。米渣中蛋白质含量55%以上,其中75%~90%是谷蛋白。米谷蛋白中含大量酰胺基氨基酸,其谷胺酰胺含量达18.29%。谷氨酰胺可以为机体提供必需的氮源,促使肌细胞内蛋白质合成,提高机体的抗氧化能力和机体免疫力,谷氨酰胺在维持小肠代谢、结构和功能上也起重要的作用,因此,谷蛋白可以作为一种营养补充剂添加到食品中。目前,谷蛋白的提取多采用Osborne方法。但米渣不同于大米,由于高温液化作用,蛋白质和多糖物质紧密结合在一起,在碱提过程中,有部分多糖和蛋白质一起溶出;同时,在酸沉淀时也有部分多糖和蛋白质一起沉淀,从而影响了蛋白质的纯度。刘骥采用碱法提取米渣蛋白,纯度低于80%,黄河龙以米糟为原料碱提的蛋白纯度也仅有73.2%。因此本实验采用α-淀粉酶法纯化米渣谷蛋白,在碱提之后,加入α-淀粉酶法水解提取液中的多糖,从而提高蛋白质的纯度,并研究了食品体系中常见的三种因素(pH、盐离子和多糖)对米渣谷蛋白功能性质(溶解性、乳化性和乳化稳定性)的影响,为其在食品中的应用提供理论指导。1材料和方法1.1实验试剂和仪器脱脂米渣江西恒天实业有限责任公司,蛋白质59.22%、水分6.23%、脂肪1.15%、灰分7.36%、粗纤维4.28%;石油醚、浓硫酸、氢氧化钠、乙醇、氯化钠等天津市大茂化学试剂厂,分析纯;高温α-淀粉酶诺维信(中国)投资有限公司,酶活力单位为4000u/g。KDY-9820凯氏定氮仪厦门精艺兴业科技有限公司;T6紫外分光光度计北京普析通用有限公司;冷冻干燥机FD-1北京德天佑科技发展有限公司。1.2实验方法1.2.1不同提取方法的提取效果米渣中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,根据它们在不同溶剂中的溶解性不同,参考Osborne的方法分别用25℃蒸馏水、5%NaCl、70%乙醇和0.1mol/LNaOH提取。工艺流程(每一步骤重复三次)如下:分别合并三次的上清液,一部分采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,另一部分透析除去小分子物质后,清、球和谷蛋白分别在等电点pH4.1、4.3和4.8沉淀,所有组分分别进行冷冻干燥。1.2.2米渣谷蛋白的提取称取100g脱脂米渣以液固比10mL/g溶于一定量的0.1mol/LNaOH溶液中,并置于50℃的水浴中浸提1h,将浸提液在4800r/min下离心10min,沉淀按上述方法重复提取两次,合并三次的上清液,得到米渣谷蛋白粗提液。将米渣谷蛋白粗提液于水浴锅中保温至65℃,调pH至6.3(淀粉酶生产厂家推荐的最佳值)。加入一定量的α-淀粉酶,水解一段时间后调pH至4.8进行酸沉,将沉淀分别用5%NaCl、70%乙醇和蒸馏水洗涤3次,除去碱提过程中提取出的球蛋白、醇溶蛋白、清蛋白以及残留的无机盐。再用0.1mol/LNaOH调pH至中性,然后进行冷冻干燥,最后得米渣谷蛋白粉。采用全自动凯氏定氮仪测定谷蛋白粉的蛋白含量,并计算谷蛋白提取率。1.2.3蛋白质溶解度的测定称取一定质量的米渣谷蛋白置于不同pH的缓冲液、不同盐离子浓度和不同多糖浓度的去离子水中,在常温下搅拌1h后,在10000r/min转速下离心10min,收集上清液,用考马斯亮蓝法测定其中蛋白质浓度,以谷蛋白的氮溶解指数(NitrogenSolubleIndex,NSI)来表示蛋白质的溶解度。1.2.4sds乳化活性及乳化稳定性测定称取米渣谷蛋白,溶解到于不同pH的缓冲液以及不同盐离子浓度和不同多糖浓度的蒸馏水中,配成蛋白浓度0.1%的溶液。在设定温度下搅拌1h后,取9mL蛋白溶液与1mL大豆油混合,放入40mL离心管中。在机械乳化机下乳化1min(12000r/min),将乳化液迅速倒入25mL小烧杯中。取样点固定在离烧杯底部0.5cm处,取50μL的乳化液与5mL0.1%的SDS混合,在500nm处测定,用0.1%的SDS做空白对照。以乳化活力指数(EmulsificationActivityIndex,EAI)表示谷蛋白乳化活性:式中,N:稀释倍数;C:乳化液形成前蛋白质水溶液中蛋白质浓度(g/mL);Φ:乳化液中油的体积分数(L/L)。静置10min后重新取样测定吸光值(A10),乳化稳定性用乳化稳定指数(EmulsifyingStabilityIndex,ESI)表示:式中,Δt=10min;ΔA=A0-A10。2结果与讨论2.1米渣的蛋白质主要成分米渣中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的相对百分含量及纯度见表1。米渣中蛋白质主要成分是谷蛋白,其他三种蛋白含量很低,不到1%。由于高温液化作用,有66.72%的蛋白质未被提取出来,但其基本组成仍是谷蛋白。四种蛋白的纯度均不高,主要杂质是可溶性多糖和盐类物质。2.2-淀粉酶添加量对米渣谷蛋白提取的影响α-淀粉酶添加量及酶解时间对米渣谷蛋白的纯度及提取率的影响见图1。α-淀粉酶的添加可以明显提高蛋白质的纯度,α-淀粉酶添加量越大,蛋白质纯度越高。当添加0.5gα-淀粉酶水解3h时,米渣谷蛋白的提取率达到90.12%。同时酶解时间越长,蛋白质的纯度也越高,酶解5h(α-淀粉酶添加量为0.3g)时,蛋白质的纯度高达90.89%。但α-淀粉酶添加量及酶解时间均对谷蛋白提取率影响不大,均在31%左右。2.3米渣谷蛋白乳化性及乳化稳定性的变化随着pH的变化,蛋白质表面的带电情况及溶解度随之变化,乳化与乳化稳定性同样也发生变化。米渣谷蛋白的溶解性、乳化性及乳化稳定性与pH的关系见图2。谷蛋白的溶解度在pH5.0(等电点附近)时最小,在低于或高于pH5.0时,蛋白质分别带净的正电荷和净的负电荷,带电氨基酸残基的静电推斥和水合作用促进了蛋白质的溶解,溶解度增加,且碱性条件下的溶解度明显高于酸性条件下的溶解度。通常蛋白质溶解度和乳化性或乳化稳定性间呈正相关,同样米渣谷蛋白乳化性及乳化稳定性变化趋势与溶解性有相似之处,在pH5.0,乳化活力最小且乳化稳定性也最低。这是因为在等电点附近,蛋白质溶解度最低,吸附在油-水界面的蛋白质减少,界面面积小;且在等电点处,蛋白质表面净电荷为零,蛋白质的亲水性降低,因而导致其乳化活力及乳化稳定性在该点时最低;而随着pH高于或低于5.0,蛋白质的溶解度增大,更多的蛋白质移动到油-水界面,溶液界面蛋白膜加厚,使得蛋白质的乳化性增大,同时当pH远离等电点时,蛋白质的净电荷增多,增加了分子间的静电斥力,使离散双电层加厚,避免了液滴的聚集,因此乳化稳定性能得到提高。2.4盐离子浓度对乳化稳定性的影响盐离子强度(以NaCl浓度表示)对米渣谷蛋白的溶解性、乳化性及乳化稳定性的影响见图3。由图3可以看出,NaCl浓度在0%~2.5%范围内,谷蛋白的溶解性和乳化性均呈现先升高后降低的趋势,乳化稳定性则相反。在NaCl浓度为0.5%时,溶解性和乳化性均达到最大,NSI和EAI分别为7.24%和3.25m2/g。在低盐浓度(<0.5%),盐离子浓度的升高,会增加蛋白质表面的电荷,增强蛋白质分子与水分子的作用,从而使蛋白质在水溶液的溶解度增大,相应乳化性也随之提高。当盐浓度大于0.5%时,盐离子与水分子结合,降低了蛋白质的水合作用,导致蛋白质分子间的作用力增大,即降低了蛋白质溶解度,蛋白质的乳化性也随之降低。米渣谷蛋白的乳化稳定性则呈现相反趋势,在低盐浓度(<1.0%)时,盐离子浓度的增加,乳化稳定性下降,当盐浓度大于1.0%时,乳化稳定性随盐离子浓度增大而增大;表明蛋白质间的静电作用力对乳化稳定性的影响比蛋白质的溶解性对其的影响更大。2.5卡拉胶乳化机理卡拉胶对米渣谷蛋白溶解性、乳化性及乳化稳定性的影响见图4。结果表明,随着卡拉胶浓度增大,蛋白质的溶解性和乳化性均逐渐提高。卡拉胶作为一种阴离子多糖,当蛋白质也带净的负电荷时,卡拉胶能与蛋白质分子片段上带正电荷的区域发生静电吸引,形成可溶性复合物,这种复合物可以大大提高蛋白质的乳化活性。蛋白质与卡拉胶的结合,使得界面蛋白膜加厚,其乳化稳定性大大提高。但当卡拉胶浓度达到一定程度(1.0mg/mL),继续增加卡拉胶,过量的未与蛋白质结合的卡拉胶会因渗透压的差异造成乳液的排斥絮凝,从而破坏蛋白质的乳化稳定性。3不同ph对米渣谷蛋白乳化稳定性的影响采用α-淀粉酶对米渣谷蛋白碱提液中多糖酶解,能显著提高蛋白质的纯度,且随着α-淀粉酶添加量的增大和酶解时间的延长,蛋白质的纯度也随之提高。分离提纯的米渣谷蛋白的功能性质受食品体系本身因素的影响,其中pH、NaCl浓度和卡拉胶浓度对米渣谷蛋白的溶解性、乳化性和乳化稳定性影响较大。碱性pH有利于谷蛋白的溶解,并提高了其乳化性能及乳化稳定性;当溶液pH为10时,谷蛋白的NSI、EAI和ESI分别为48.94%、10.62m2/g和27.00min。低浓度盐也能促进谷蛋白的溶解,提