云南农业大学微生物实验综合报告

云南农业大学微生物实验综合报告一、前言：通过微生物学实验，我们要熟悉微生物实验所需的各种常用器皿的名称、规格、清洗方法，以及了解干热灭菌的造作过程。了解配制培养基的原理，掌握培养基的配制、灭菌方法。学会应用菌落形态特征比较不同场所、不同条件下细菌的数量和类型。掌握无菌操作技术，能够分离、纯化菌种。了解T、化学药品对微生物生长的影响。二、材料与方法：（1）材料：云南农业大学校园内花坛中的土壤、经过高压蒸汽灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基（含培养皿）10个、接种针、酒精灯、电子天平、装有90ml无菌水的三角瓶1个、装有9ml无菌水的试管4支、高温干燥灭菌移液管5支、培养箱一台。（2）方法与步骤①土壤稀释液的制备A.称取土样10g放入盛90ml无菌水的三角瓶中，振荡15~20分钟，使微生物细胞分散。B.将土壤悬浮液置于沸水中煮10~20分钟，静置冷却，即成10-1的土壤悬液。C.另取装有9ml无菌水的试管，编号为10-2、10-3、10-4及10-5，用移液管吸取10-1土壤悬液1ml，加入编号10-2的无菌试管中，吹吸三次，使之混匀，即成10-2的土壤稀释液，以此法继续制作10-3、10-4及10-5等一系列的土壤稀释液（一定要每次换一个移液管）。②平板接种培养浇混接种法A.每组取灭菌培养皿9套融化冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基。B.在无菌平板编上10-1、10-2、10-3、10-4及10-5号码，每一号码设置三个重复，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。C.用移液管吸取相应的土壤稀释液1ml放在灭菌培养皿上。D.倒入冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基20ml。迅速轻轻摇匀。E.牛肉膏蛋白胨培养基平板倒置于37℃条件下培养，2~3天后，观察菌落形态及计数菌落，并计算出每克土壤中微生物的数量。如果样品稀释适当的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。F.挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，至最后得到纯培养为止③菌落技术规则A.计算相同稀释度的平均菌落数有较大片菌落生长时，弃用，以无片菌落生长的平皿计数；B.选择平均菌落数在30~300间的平板I.只有一个稀释度复合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；II.有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以地稀释度的菌落数的值）：i.若0.5≤比值≤2，以两稀释度的菌落数乘以稀释倍数所得的值的均值报告。ii.若2≤比值或比值≤0.5，则取其中较少的菌落总数进行报告III.若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；IV..若所有稀释度的菌落平均数均大于30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；V.每毫升样品中微生物细胞数=每皿菌落平均数×稀释倍数×1/取样体积④革兰氏染色A.制片：取菌种培养物常规涂片、自然干燥、加热固定B.涂片朝上，在火焰上方过几次以热固定菌体（此操作的目的是湿的细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上）。固定时通过火焰1~2次即可。注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏细胞形态。C.初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为宜）初染1~2分钟，水洗。D.媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖1分钟，水洗E.脱色：用乙醇脱色20~30秒，水洗F.复染：滴数滴番红于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为宜）复染1~2分钟，水洗。⑤显微操作A.低倍镜观察B.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央第一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物像为止。C.换片，另换新片，必须从第一条开始操作。D.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后在用擦镜纸沾少许酒精乙醚混合液擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的酒精乙醚混合液，后将镜体完全复原。（使用后务必确保镜头擦拭干净！）三、结果与分析土壤菌落数统计表稀释液处理10-310-410-5123123123菌落数889211019172010162平均数96.66718.6679.333革兰氏染色结果菌种对照A对照B分离菌株革兰氏染色反应蓝紫色/G+红色/G-蓝紫色/G+形态长杆菌短杆菌长杆菌结论：被测土壤中的细菌数约为9.6667×104个，且其中含有革兰氏阳性的杆菌。附：本次试验其他实验结果环境和人体表面微生物测定处理①②③④⑤⑥⑦⑧CK落菌数665011136141500备注：①：用未洗过的手指头在平板上涂抹②：用洗手液洗过的手指头（不用毛巾擦）在平板上涂抹（用力一致）③：对着琼脂平板上用力咳嗽④：稍稍打开嘴唇压在培养基上⑤：琼脂平板上，用手将头发用力摇动数次⑥：用旧纸币在培养基上拖动⑦：按无菌操作要求在酒精灯火焰便打开皿盖1分钟⑧：打开培养皿置实验台上（空气中）10分钟⑨：对照（用到还得牛肉膏蛋白胨平板）温度对大肠杆菌的影响温度4℃28℃37℃50℃生长状况（—）（++）（+++）（++）OD值-0.0110.3750.5180.500pH值对大肠杆菌的影响温度4.07.09.0生长状况（+）（+++）（++）OD值0.0280.5180.500备注：（—）为不生长