中国农业大学生化实验报告

实验九酵母核糖核酸的提取及测定植物117左宜平1101080709实验日期2012年11月4日实验背景核酸是生命的最基本物质之一，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内。对核酸的研究是更深入研究生命体的基本前提之一。研究核酸需要纯度很高的核酸，所以核酸的提取方法也就在生物学研究中相当重要。本次实验提取酵母的核糖核酸（RNA）。RNA离体后稳定性很差，含量低，所以在提取的时候就要注意防止核酸的降解和变性，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止RNA酶的作用。本实验是医药卫生领域与大工业生产的基础方法。实验目的了解从酵母中提取RNA的方法并掌握其测定手段。实验原理微生物是工业上大量生产核酸的原料，其中以酵母最为理想，因为酵母核酸中主要是RNA，DNA含量很少，菌体容易收集，RNA也易于分离。此外，抽提后的蛋白质还具有很高的利用价值。RNA提制过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去，再根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将pH调到2.0-2.5使RNA沉淀，进行离心收集工业上常用的提取RNA的方法主要有稀碱法和浓盐法，前者利用碱使细菌细胞壁溶解，使RNA释放出来，这种方法抽提时间短，但RNA在此条件下不稳定，容易分解；后者是在加热条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来，此方法易掌握，产品颜色较好，用浓盐法提取RNA时应注意掌握温度，避免在20~70摄氏度之间的时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围，会使RNA因降解而降低提取率，利用加热，至90~100摄氏度使蛋白质变性，破坏该类酶，有利于RNA的提取。若要提取接近天然状态的RNA，可采用苯酚法或氯仿——异戊醇法除去蛋白，然后乙醇沉淀RNA，离心收集。本实验采用浓盐法（10%NaCl）核酸不论是DNA还是RNA，都是由核苷酸组成的多聚核苷酸化合物。而核苷酸是由磷酸，碱基和核糖构成的。因为核酸分子中的碱基核糖和磷酸是以等分子比例存在的，所以要测定生物体内核酸的含量或者测定提取出来的核酸含量，只需测定组成核酸的一种成分，如磷酸，糖或碱基，便可计算出核酸的含量。目前测定核酸含量的方法有：定磷法，测定RNA和DNA戊糖测定法，测RNA脱氧戊糖测定法，测DNA紫外吸收法，测DNA和RNA微生物测定法，测DNA应用同位素研究的方法，测定DNA和RNA其中方法5.，6为一些特殊研究之用，应用面较窄，方法1,2,3,4为较普遍的核酸测定手段。本实验采用方法4来测定核酸含量。因为核酸的组成成分嘌呤碱及嘧啶碱具有强烈的紫外吸收，最大吸收在260mm处，利用此测定可以对核酸进行定量测定。实验材料，仪器和试剂1.材料干酵母粉精密pH试纸2.仪器量筒：50ml具塞试管：15ml×2三角瓶：100ml容量瓶：25ml×1,50ml×2烧杯：250ml×1,100ml×1,50ml×1,10ml×1移液器烘箱离心机（上海安亭科学仪器厂）分析天平（上海精密科技仪器长）紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）3.试剂10%NaCl6NHCl95%乙醇（分析纯）3%—5%的氨水RNA沉淀剂：取0.5g钼酸铵，加水193ml，加7ml70%过氯酸，总体积200ml实验步骤1.提取称取7g酵母粉，置研钵中，小心研碎成粉末，倒入三角瓶中，然后取50ml10%的氯化钠溶液，倒入三角瓶，使酵母粉充分彻底悬浮，之后小心放入沸水浴中，搅拌1~2分钟后，浸提半小时。2.分离将上述提取液取出，于冷水浴中彻底冷却约5分钟，转入离心管，以3500转/分钟30分钟，使提取液以及菌体残渣等分离。3.沉淀RNA将离心得到的上清液，小心倾倒于50ml的小烧杯中，并置于冰浴上冷却3~5分钟，待溶液冷至10℃以下后，于冰浴中，在搅拌的情况下小心地用6NHCl调节PH至2.0~2.5.随着PH的下降，溶液中白色沉淀逐渐增加。到等电点时沉淀量最多（注意严格控制PH），调好后继续于冰水中放置10分钟使沉淀充分，颗粒变大。4.洗涤纯化上述悬浮液夏新转入离心管，以3000转/分钟离心10分钟，得到RNA沉淀。小心倾去上清液，直接于离心管中用95%乙醇洗涤RNA三次，每次用15ml乙醇，充分搅拌洗涤，然后以3000转/分钟分别离心10分钟，5分钟和5分钟。由于RNA不溶于乙醇，用乙醇洗涤不仅可脱水，使沉淀物疏松，便于过滤、干燥，而且可除去可溶性的脂类及色素等杂志，提高了制品的纯度。5.干燥用牛角勺仔细将洗涤后的RNA沉淀从离心管内挖出涂布于事先将边缘折起成框的硫酸纸上，涂布均匀后小心置于80℃烘箱内5分钟左右，使沉淀充分干燥。将干燥后的RNA制品连同硫酸纸一起准确称重，而后小心将RNA制品的大部分转移至匀浆器中，将硫酸纸以及残余的RNA制品再次称重，记录下所有数据，以求得RNA总制品重量，用以计算RNA含量。6.含量测定采用比消光系数法，比消光系数是指单位浓度的核酸溶液的消光值A260（1微克/毫升RNA的消光值），本实验给定的A260=0.032.测定步骤：在第5步中转移到匀浆器中的定量RNA样品中加入5ml蒸馏水，调匀后溶解，而后用5%氨水小心调成PH至7.0，最后转入25ml容量瓶中，用蒸馏水定容（此为被测样品体积）。用两支试管，按下表操作：管号RNA液H2O沉淀剂A5ml5ml——B5ml——5ml摇匀，冰浴20分钟，然后转入离心管中3500转/分钟离心10分钟，小心留取上清液，各取0.5ml容量瓶中，用蒸馏水定容，然后用其中一个做标准空白液，在紫外分光光度计上测定OD260值。数据整理及结果计算1.原始数据：称取酵母粉重量W=7g空白硫酸纸重W1=0.6184g总制品+纸重W2=0.7158g残余制品+纸重W3=0.6377g比消光系数A260=0.022测定消光值OD260=0.1922.推衍数据：总制品重G1=0.0974g定量制品重G2=0.0781g3.结果计算⑴RNA含量=（E260/A260）×V×D×（1/G2）×100%=0.192/0.032×50×200×0.000001/0.0781×100%=76.82%⑵RNA提取率=（RNA含量×G1）/W×100%=76.82%×0.0974/7×100%=1.07%4.结果分析通过本次我们学会了如何提取RNA以及测定其含量。从得到的数据来看，提取的样品纯度还不是太高，但查阅资料得知浓盐法提取得到的RNA纯度应该比稀碱法要高，由此可知，在实际的生产中，最常用的此两种方法的到的RNA产品的纯度都不是很高。本实验的提取率在实验过程中损失了不少，例如在用硫酸纸转移的时候因为硫酸纸的弹性而使得一小部分产物掉落。本实验中有很多操作细节需要相当严谨的完成，比如水浴时间，离心时间，沉淀取上清液等等，只要小心翼翼充分细心的做好这些细节工作，产率会有一定的提高。思考题1.本实验在紫外法测定RNA含量时，为什么要固定测定液的pH值，若pH值不同，会影响测定结果吗？为什么？用紫外法测定RNA含量的原理之一是嘌呤和嘧啶环具有共轭双键，使核酸在260nm处有最大吸收峰值，如果溶液的pH不固定，使紫外吸收值也不同，测得的浓度不准确。在测定中，加钼酸铵——过氯酸沉淀剂的作用是什么？离心出去沉淀后，其上清液为什么要喜事100倍？加沉淀剂是为了使RNA沉淀，以获得除去RNA之外其他所有试剂的待测液，作为空白对照标定来测定RNA含量。实验依据朗伯比尔定律A=εbc，其中ε和b都已确定，而且A的数值在0.2~0.8之间误差最小，结果最为可靠，因此需要稀释溶液使A在该范围内。物质分离纯化的总体策略是什么？而分离纯化生命大分子是否有特别要注意的事项？为什么？总体策略：保持物质活性，结构完整，纯化到所需浓度，能够大量提纯（量产）。分离纯化生命大分子时要注意：保持所提取物质活性；抑制或避免接触所能分解被提纯物质的酶，以免物质被酶分解；反应条件应温和，避免能破坏生命大分子的因素。实验小结通过本次我们学会了如何提取RNA以及测定其含量。从得到的数据来看，提取的样品纯度还不是太高，但查阅资料得知浓盐法提取得到的RNA纯度应该比稀碱法要高，由此可知，在实际的生产