酶的活力测定及分离提取完整版

酶的活力测定及分离提取一、酶活力的测定（一）活力（性）的表示方法（二）测定二、酶的分离提取一、酶活力的测定（一）活力（性）的表示方法１、活力——v

测定酶活力就是测定酶促反应速度。

v

：单位时间内产物的生成量。 单位时间内底物的消耗量。2、酶的活力单位（U）：一定条件下，单位时间内催化一定量的底物起反应所需的酶量。1个酶活力单位（U），是指在特定条件下，在1分钟内能转化1微摩尔（μmol）底物的酶量或是转化底物中1μmol的有关基团的酶量。1972年国际生化协会酶学委员会推荐了一个新单位：Kat——1秒钟内转化1mol底物的酶量。1Kat=6×107U为了方便起见，有时用习惯法表示，如GPT的King氏单位。即100ml血清与足量的丙氨酸、a－酮戊二酸在37℃保温1h，每生成1umol丙酮酸为1个单位。α—淀粉酶可用每小时催化1克可溶性淀粉液化所需要的酶量来表示。3、酶的比活力单位质量样品中的酶活力。如：1mg蛋白质中所含的U数。1Kg蛋白质中所含的Kat数。比活力＝活力单位数(IU)蛋白质（mg）比活力＝活力单位数(IU)酶制剂（g）可表示酶制剂的纯度。在酶的提纯过程中，随着酶逐步被纯化，其比活力也在逐步增加，比活力越高，表明E愈纯，在酶的提纯过程中，E的总活力数会减少，但比活力却渐渐增加。4、酶的转换数Kcat

每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数。

也即酶将底物转化为产物的效率。（二）测定要求：测定初速度 最适条件

[S]>>[E]活力测定常用方法：化学滴定法、比色法、比旋光度法、气体测压、测紫外吸收、同位素技术。二、酶的分离提取选材→细胞破碎→提取→纯化→浓缩注意：防止蛋白质变性。第五节影响酶促反应速度的因素一、酶促反应速度的测量二、酶浓度对υ的影响三、底物浓度的影响四、pH对υ的影响五、温度对υ的影响六、激活剂对υ的影响七、抑制剂对υ的影响一、酶促反应速度的测量酶促反应速度可表示为：

①单位时间内底物的消耗量

②单位时间内产物的生成量[t][P]0斜率=──=υd[P]d[t]酶反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素。在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量<5%时的反应速度。二、酶浓度对υ的影响反应条件固定且[S]>>[E]下[E]V0υ=K[E]三、底物浓度对υ的影响（一）[S]对υ的影响（二）米氏方程（三）Km（一）[S]对υ的影响[S]V0ABCDpH、T、[E]固定?（二）米氏方程

Michaelis和Menten根据中间产物学说推导了能够表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的公式，称为米氏方程式。1、基础

中间产物学说S+E

ES

P+E（1）S与E形成中间产物，且整个反应速度取决于ES→P+E，即：V=K2[ES]（2）产物浓度P→0（初速度）

·[S]>>[E]

·反应达到动态平衡（ES的生成=ES的消失）2、前提S+E

ES

P+EK1K-1K2K-2K-2忽略不计[S][Et]-[ES][ES]Km=K-1+K2K1=Vmax[S]Km+[S]V3、推导（1）[S]很小时[S]<<Km则

一级反应（2）[S]很大[S]>>Km则V=Vmax

零级反应（3）[S]处于Km附近时，

混级反应V=VmaxKm[S]4、可用于判断反应级数V=Vmax[S]Km+[S]（三）米氏常数Km1、意义V=Vmax[S]Km+[S]当V=—Vmax时1

2Km=[S]Km的物理意义：当酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。几种酶的Km值酶底物Km（mmol·

L-1）过氧化氢酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸己糖异构酶蔗糖酶精氨酸-tRNA合成酶谷氨酸脱氢酶H2O26-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖

蔗糖（天然底物）棉籽糖

精氨酸tRNA（天然底物）谷氨酸α－酮戊二酸NAD+250.0580.7283200.0030.00040.122.00.025大多数酶的Km介于10-6~10-1mol·

L-1①Km为E的特征常数，在一定条件下为固定值。②Km与酶浓度无关，但与T、pH有关③Km可近似表示酶与底物的亲和力，Km值越大，亲和力越小。Km可用来判断酶的最适底物。其他意义E+Sk+1k-1k+2ESE+Pk-1+k+2k+1Km=2、Km的求法——双倒数作图法V=Vmax[S]Km+[S]1

V=Km

Vmax1

[S]+1

Vmax与直线方程y=ax+b相当双倒数作图法-1

Km1

V1

[S]1

Vmax四、pH对υ的影响

每一种酶只能在一定pH下才能表现酶反应的最大速度，高于或低于此值，反应速度都会下降，通常称此pH值为酶反应的最适pH值。pHV最适pH（1）一般酶最适pH4~8（2）植物5~6.5动物6.5~8（3）最适pH与等电点不一定一致。

如胃蛋白酶最适pH<pI

胰蛋白酶最适pH=pI

蔗糖酶最适pH>pI（4）酶的最适pH不是酶的特征性常数。（1）pH影响E结构的稳定性，过酸、过碱会强烈影响酶蛋白的构象，甚至使E变性失活。（2）pH影响E分子上某些基团的解离状态。（影响结合基团、催化基团的解离—酶活力降低影响活性中心构象—影响酶专一性）（3）pH影响S分子某些基团的解离状态。酶有最适pH的原因五、温度对反应速度的影响一般来说，酶促反应速度随温度的增高而加快。但当温度增加达到某一点后，由于酶蛋白的热变性作用，反应速度迅速下降，直到完全失活。酶促反应速度随温度升高而达到一最大值时的温度就称为酶的最适温度(optimumtemperature)。温度对υ的影响V最适T·T升高，活化分子数增多,υ加快·T升高，酶蛋白变性,υ降低Q10温度系数：T每增加10℃，υ增加的倍数。注意（1）动物体内最适T一般30~50℃，植物40~60℃，有少数酶能耐较高的温度，如某些细菌中分离的DNA聚合酶，最适温度可达70℃，细菌淀粉酶在93℃下活力最大。（2）最适T，不是酶的特征常数，它与酶作用时间的长短、底物种类以及pH有关。（3）低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，但温度升高后，酶活性又可恢复。六、激活剂对υ的影响

能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂。1、无机离子阴离子Cl－、Br－；阳离子H+

金属离子（Zn2+、Cu2+、K+等）。2、中等大小的有机分子：GSH、Cys、VC、巯基乙醇、EDTA（乙二胺四乙酸）等。3、蛋白质物质。七、抑制剂对υ的影响（一）抑制作用的概念（二）不可逆抑制剂（三）可逆抑制剂（一）抑制作用的概念1、失活作用：凡使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用。2、抑制作用：使酶活力下降，但并不引起酶蛋白变性的作用。（此作用使一部分酶的必需基团或辅助因子失活（活力变小））。3、抑制类型（1）不可逆抑制：I与E共价结合，是一不可逆反应，二者结合后，不能透析除去抑制剂而恢复酶活力，称为不可逆抑制作用。（2）可逆抑制：I与E非共价结合，为可逆反应，透析能除去抑制剂使酶恢复活力，称为可逆a抑制作用。[E]

无I可逆I不可逆I可逆与不可逆抑制剂的区别（一）[E]

[I]可逆与不可逆抑制剂的区别（二）[E]

[I]可逆I不可逆I（二）不可逆抑制剂I与E共价结合，是不可逆反应，不能透析除去。常见不可逆抑制剂：烷化剂、酰化剂、氧化剂、有机磷、有机贡、氰化物、氮化物、重金属。1、羟基酶抑制剂2、巯基酶抑制剂3）重金属盐类金属离子Cu2+Hg2+Pb2+Ag+Fe3+等在高浓度时与酶蛋白结合成不溶性盐而变性失活在低浓度时产生抑制作用4）氰化物、硫化物和CO与酶中的金属离子形成较为稳定的络合物，使酶的活性受到抑制与细胞色素氧化酶的铁卟啉结合，抑制呼吸作用5）青霉素抗菌青霉素与糖转肽酶Ser－OH结合，使酶失活该酶催化细菌细胞壁中肽聚糖链的聚合，酶失活，细胞壁合成受阻，细菌生长受阻，青霉素起抗菌作用（三）可逆抑制剂I与E非共价结合，可透析除去。竞争性抑制剂——I与S结构相似竞争与E的结合部位结合。非竞争性抑制剂——I与S结合在酶的不同部位。反竞争性抑制剂——E必须先与S结合，然后才与I结合竞争性抑制（competitiveinhibition）抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低，称为竞争性抑制作用。酶的竞争性抑制反应模式+IEIk+3k-3k+2E+SE+PESk+1k-1竞争性抑制的速度方程与图形特征Vmax

KmKm'[S]Vmax/2KmVm[S]·=(1+[I]Ki）+[S]竞争性抑制的双倒数方程竞争性抑制的双倒数图形特征⑴竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；⑵抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同；⑶抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；⑷动力学参数：Km值增大，Vm值不变。竞争性抑制剂的特点2.非竞争性抑制（noncompetitiveinhibition）抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与ES复合物结合，使酶的催化活性降低，称为非竞争性抑制。

k-3k+3+IESIk+2E+PESE+Sk+1k-1k-3k+3+IEI+Sk+1k-1反应模式Vm[S]·=

(Km+[S])(1+[I]Ki）非竞争性抑制的速度方程非竞争性抑制的图形特征非竞争性抑制的双倒数图形特征⑴非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；⑵底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；⑶抑制剂对酶与底物的结合无影响，故提高底物浓度，不能消除抑制作用。⑷动力学参数：Km值不变，Vm值降低。非竞争性抑制的特点：2．反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition)抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制。反竞争反应模式

=Vm[S]·Km

1+[I]Ki1+[I]Ki+[S]反竞争性抑制的速度方程反竞争性抑制的双倒数方程反竞争性抑制的双倒数图形特征⑴反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；⑵抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；⑶必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；抑制程度随底物浓度的增加而增加；⑷动力学参数：Km减小，Vm降低。反竞争性抑制的特点：竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制无抑制1/v1/[S]可逆抑制的动力学比较竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制结合部位活性中心活性中心以外活性中心以外增加底物浓度消除抑制不能消除抑制不能消除抑制Vmax不变降低降低Km增加不变降低第六节酶的活性调节一、变构调节二、同工酶三、共价调节生物体内的各种生理活动均以一定的物质代谢为基础。为了适应某种生理活动的变化，需要对一定的代谢活动进行调节。通过对酶的催化活性的调节，就可以达到调节代谢活动的目的。可以通过改变其催化活性而使整个代谢反应的速度或方向发生改变的酶就称为限速酶(limitingvelocityenzyme)或关键酶(keyenzyme)。一、变构调节（别构调节）某些代谢物能与变构酶分子上的变构部位特异性结合，使酶的分子构象发生改变，从而改变酶的催化活性以及代谢反应的速度，这种调节作用就称为变构调节(allostericregulation)。酶的变构调节作用具有变构调节作用的酶就称为变构酶(allostericenzyme)。凡能使酶分子变构并使酶的催化活性发生改变的代谢物就称为变构剂(allostericeffector)。S型曲线：正协同效应v[S]50米氏方程双曲线变构酶S型曲线变构酶的特点1、一般由两个或以上的亚基组成（寡聚酶），除有活性部位外，还有与调节物结合的调节部位（变构部位）。2、具有变构效应：当底物或效应物和酶分子上的相应部位结合后，会引起E分子构象的改变，从而影响E的催化活性。3、不符合米氏曲线，多数为S型。4、变构酶分子中一个活性部位能影响同一分子的另一个活性部位。变构酶的解聚与聚合C——催化亚基R——调节亚基变构酶活性调节的机理齐变模型亚基1亚基2SSSSTTRTRRRRSS序变模型天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）胞苷三磷酸（CTP）结构：12个亚基，6个催化亚基（C），6个调节亚基（R）激活剂：ATP抑制剂：CTP（反应途径的终产物）氨甲酰磷酸+天冬氨酸↓（ATCase）氨甲酰天冬氨酸↓↓CTP结合于调节亚基，导致催化亚基构象发生变化，酶活性降低，直至CTP浓度恢复ATCaseATP（正效应剂）CTP（负效应剂）低催化活性构象T(tense)-态CCCCCC

RRRRRRCCCCCC高催化活性构象R(relax)-态RRRRRRRMW3100006个340006个17000一、变构酶天冬氨酸转氨甲酰酶变构酶的S形曲线v米氏酶变构激活[S]变构抑制变构激活变构酶非调节酶动力学特点：不符合米氏方程，v-[S]曲线为S形二、同工酶的调节催化同一反应，但组成、结构、性质有所不同的一组酶。或能催化相同化学反应的数种不同分子形式的E，称为同工酶(isoenzyme)。同工酶在体内的生理意义主要在于适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要。LDH亚基分为M型和H型，4个亚基组成M型（肌型）——含碱性氨基酸H型（心型）——含酸性氨基酸LDH的5种四聚体：例：乳酸脱氢酶

由两个基因（H、M）指导合成，则有H、M两种亚基，他们之间相互组合，就会出现五种同工酶。HMLDH1

(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5

(M4)不同组织中LDH同工酶的电泳图谱LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌肾肝骨骼肌血清-+原点心、肝病变时引起的血清LDH同工酶的变化规律：

心脏疾病初期

LDH1和LDH2上升，LDH1增高更早。

急性肝炎

LDH5明显上升，随病情好转而恢复正常。

同工酶产生的机制不同的基因一组同工酶1.单体酶2.寡聚酶不同的基因一组同工酶（二）同工酶在代谢调控中的作用天冬氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸半醛高丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸赖氨酸AK1AK2AK3

几种同工酶的存在，可能是机体对环境变化或代谢变化的另一种调节方式，当一种同工酶受到抑制或破坏时，其他同工酶仍然起作用，从而保证代谢的正常进行。(三)研究同工酶的意义1.同工酶可以作为遗传标志，进行遗传分析、杂种优势的筛选、抗逆指标筛选心、肝病变时引起的血清LDH同工酶的变化规律：心脏疾病

H4上升;急性肝炎

M4明显上升，随病情好转而恢复正常。2.同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断3.研究代谢规律、个体发育三、共价修饰调节：酶蛋白分子中的某些基团可以在其他酶的催化下发生共价修饰，从而导致酶活性的改变，称为共价修饰调节。共价修饰调节也是体内快速调节代谢活动的一种重要的方式。最常见的共价修饰方式有：磷酸化-脱磷酸化，-SH--S-S-，乙酰化-