放线菌扫描电镜样品制备方法的筛选

放线菌扫描电镜样品制备方法的筛选

自从威尔逊和davius1成功使用扫描电镜观察和研究放线菌以来，科学官员对大量菌株进行了检测和观察。改进的样品制备方法和机器操作方法，使样品在高放大下具有更高的分辨率。通过对不同属的菌体精细结构进行研究,获取了一系列与形态相关的有用信息,使之一直作为区分和鉴定种属的重要手段。放线菌样品在扫描电镜进行观察之前,一般都需采用固定、脱水、干燥及表面镀金等处理［2］。但因放线菌这类微生物体积微小,不但收集菌体困难,而且在处理时大量样品会流失,也不能保持微生物生长的自然状态。如何避免制备过程中的失水、变形、丢失及损伤等问题是获得满意观察结果的关键。从取材来源到处理方法,都将直接影响观察效果,初学者很难把握。本文通过对放线菌链霉菌扫描电镜观察,对不同的取材来源、样品处理方法进行比较。同时,对简便快速方法进行尝试,比较和总结影响放线菌扫描电镜观察结果的主要因素,筛选出简便、合适的样品制备方法进行放线菌扫描电镜观察,获得丰富满意的观察结果,同时为进一步开发利用新的实验方法提供理论依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1scabrusporus135545445555555105105545451010101010101010.5.10.7.4.10.7.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4与16srrna序列的scablusporus链霉菌Bn035(Streptomycesscabrisporus),由本实验室新分离鉴定(16SrRNA序列Genbank登录号为KC440853)、高氏1号培养基斜面4℃保存。1.1.2培养基和试剂PDA培养基(去皮马铃薯20g、葡萄糖2g、琼脂1.5g、自来水100mL),PD培养基(不加琼脂),10%重铬酸钾溶液,pH7.2磷酸缓冲液(PBS),3%戊二醛溶液,1%四氧化锇溶液,0.85%生理盐水。1.1.3荧光显微镜正置显微镜MJ-54A高压蒸汽灭菌锅,MyCycler580BR恒温震荡器,AIRTECHVS-1300L超净工作台,OlympuFSX100型正置荧光显微镜,EMITECHK-850型临界点干燥仪,HitachiE-1010型离子溅射仪,TESCAN5136型扫描电子显微镜。1.2方法1.2.1培养基pd培养基在无菌操作条件下,刮取斜面培养的链霉菌Bn035孢子少许,制成无菌悬液。取0.2mL加入含有20mLPD培养基的三角瓶中,180r/min30℃恒温振荡培养8d;同时取上述无菌悬液0.2mL,涂布于盛有PDA培养基的平皿中,用镊子将灭菌的盖玻片以45°夹角插入培养基内(每皿3~4片),28℃恒温培养8d和14d。1.2.2酵母粉添加量的培养将样品直接用普通显微镜高倍镜镜检,确定目标的生长状况。插片样品用镊子取已生长菌株孢子丝的盖玻片,将盖玻片进行切割;菌饼样品用打孔器在固体平皿孢子丝生长密集处打孔(直径4mm);发酵液样品:吸取培养好的发酵液0.2mL。将样品分别放入含有3%戊二醛固定液的1.5mL离心管中固定24h,备用。1.2.3样品处理方法对3种取材来源的待处理样品分别采用不同固定方法和清洗溶液,对照CK是将样品戊二醛和四氧化锇双重固定、PBS缓冲液清洗,乙醇梯度脱水,丙酮置换。各样品具体处理方法见表1。全部处理样品真空干燥后,用银导电胶将样品粘在样品台上,离子溅射仪镀膜,扫描电子显微镜观察并照相,加速电压15kV。2结果与分析2.1培养8d发酵液样品电镜观察从图1可以看出,培养14d的插片样品和菌饼样品及培养8d发酵液样品,均可观察到营养菌丝体、气生菌丝体和孢子丝,孢子丝直生或螺旋状,说明在此时期将样品处理用做电镜观察适合。2.2分节细胞直径测定结果在本试验中,分别取培养8d和14d的菌饼样品处理观察,结果表明菌丝体形态范围有明显区别。由图2a(8d)显示:在这个时期,该菌形态简单,主要以营养菌丝体为主,菌丝直径0.5μm左右;由图2b(14d)显示,样品主要以未断裂的孢子链为主,同时可发现螺旋孢子链,分节孢子直径在0.5μm左右。与同样培养14d的插片样品进行比较发现,插片样品极易观察到断裂但未分散的孢子链(见图2c)。而对于发酵液样品图2d(8d)进行观察,不易观察到孢子链,孢子散落成片,单个孢子直径都在0.5~1μm。从上述4种样品扫描结果分析可知,若想获得同一菌种的最佳观察效果,必须准确把握培养时间,对于链霉菌Bn035来说,发酵液获得良好形态的菌体最快,平皿培养的插片样品次之,平皿培养的菌饼样品最慢。2.3菌种的生长形态插片样品获得的菌体图像背景简单,结构清晰,层次分明,很少有杂物干扰;菌丝和孢子排列整齐,形态正常,分散度好,孢子链延展,带有螺旋状;孢子呈圆柱形,表面褶皱(见图3a1,3a2)。菌饼样品中菌丝和孢子堆砌在一起,相互交叉重叠;部分菌丝和孢子被培养基或分泌物覆盖,要观察的部位未充分暴露,但仍可少量观察到未分节的气生菌丝体、螺旋孢子链和散落的孢子(见图3b1,3b2)。发酵液获得的菌体,真实地展现了菌丝自然生长的形态结构,大量单个孢子附着在菌丝上,或散落在培养基上,呈椭圆形,光泽、饱满、充满活力,立体感强;但无明显孢子链,菌丝表面有大量附着物(见图3c1,3c2)。2.4菌饼样品的测定在图4中,经戊二醛和四氧化锇双重固定的菌饼样品与戊二醛单固定、未经任何固定处理直接干燥喷金的菌饼样品比较,双固定和单固定样品无明显差异,均能真实、完整地反映样品的形态和结构,菌丝饱满,表面光滑,无明显皱缩和变形(见图4a,4b);未经任何固定处理直接干燥喷金的菌饼样品孢子链明显,但有部分菌丝和孢子皱缩变形(见图4c)。2.5发酵液样品的清洗由图5可知,菌饼样品在不同清洗方法处理后有明显差异,用生理盐水清洗后,有部分样品被埋没(见图5b1~5b3)。发酵液样品通过不同清洗方法处理,生理盐水清洗后的孢子表面干净、光滑,PBS和蒸馏水清洗的样品在干燥后,菌丝和孢子周围有分泌物(见图5c1~5c3)。插片样品在固定后,通过磷酸缓冲液、生理盐水或蒸馏水清洗的样品,孢子表面无明显差异(见图5a1~5a3)。2.6发酵液样品测定在图6中,菌饼样品的菌丝和孢子经乙醇或丙酮脱水,孢子皱缩明显(见图6a1,6a2)。发酵液样品经乙醇或丙酮脱水,结果无明显区别,菌丝和孢子光滑、饱满(见图6b1,6b2)。插片样品经乙醇或丙酮脱水,菌丝和孢子表面无明显皱缩(见图6c1,6c2)。3不同分析方法对于样品制备的影响Tresner等［3］利用电子显微镜鉴别链霉菌菌种,以孢子链的形态、孢子表面结构、孢子囊形状、单个孢子的构成、孢子表面的装饰物如光滑、凸起、褶皱、多刺等作为区别特征,这些特征即使在今天的放线菌分类学中也仍然十分重要。因此,孢子表面的装饰物是一种重要的分类学特征,观察到这种特征的变化以及孢子链的形态对于区分链霉菌属内各个种是很重要的［4］。扫描电镜观察需要各种形态的菌丝和孢子,而拍摄这类照片,样品制备是关键。本研究通过对不同取材来源和不同处理方式的样品进行观察,其结果进一步证实:通过合适的培养时间和取样方法才容易在一个样品中观察到各主要时期整体孢子链的丰富形态细节。另外,先在光镜下选取菌丝分散、孢子丝多的样品进行固定,节省了时间,观察效果好。目前,扫描电镜样品制备过程从固定到溅射镀膜要花掉一整天时间,并且需要先进的技术及专业知识,给放线菌电镜样品制备增加了一定的困难。本研究与常规扫描电镜制样方法比较,探究不同固定、清洗和脱水处理过程对放线菌扫描观察结果产生何种影响,结果表明不同固定、清洗、脱水处理过程影响了样品照片的清晰度和菌体数量。有研究报道蒸馏水、PBS滴在玻片上,干燥后蒸馏水无杂质残留,PBS干燥后留下了颗粒层;用水清洗样品后无杂质覆盖;用戊二醛固定后不清洗,干燥后有留下一层细微颗粒膜覆盖遮蔽样品［5，6］,与本研究结果一致。因此,结合本研究结果,建议样品如果经过固定后,要用蒸馏水或乙醇、丙酮等干燥后无残留的试剂清洗,但乙醇、丙酮会使样品收缩,用蒸馏水清洗经济又方便。另有文献报道［7］,在放线菌制样过程中不固定,省去清洗和脱