电泳技术在药物分析中的应用

电泳技术在药物分析中的应用

生检室：姚世霞

引言 电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Reŭss进行了世界上第一次电泳实验）。1937年，瑞典生化学家Tiselius发明了Tiselius电泳仪，在此基础上建立了研究蛋白质的自由界面电泳方法，利用该法首次证明人血清是由白蛋白、α、β、γ球蛋白组成，并因此于1948年获得诺贝尔奖。随后电泳技术的发展突飞猛进,特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。一.电泳的概念二.电泳技术基本原理三.电泳技术分类四.几种常见电泳方法的比较五.电泳技术在药物分析中的应用一.电泳的概念电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。电泳技术优点：快速、准确、重现性好+-二.电泳技术基本原理1.原理：

不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。

pH>pI分子带负电荷,在电场中向正极移动;

pH<pI分子带正电荷,在电场中向负极移动;

泳动速度u=v=d/t=dleV/lVt

电泳的基本原理

在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。2.影响电泳速度的因素2.1电场强度泳动速度与电场强度成正比。常压电泳(100—500V).2—10V/cm，几小时或几天；蛋白质等大分子物质;高压电泳(500—1000V).20—200V/cm，几分钟；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质.2.2溶液的pH值pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大2.3溶液离子强度离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快。2.4电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。三.电泳技术分类原则上按电泳的原理来分，可分为二类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。电泳技术分类四.几种常见电泳的比较类型优点缺点纸电泳设备操作简单分辨率差，电渗现象醋酸纤维薄膜电泳设备操作简单，样品用量少分辨率差琼脂糖凝胶电泳快速，分辨率高电渗现象严重聚丙烯酰胺凝胶电泳可调节凝胶孔径，样品用量少分辨率高，无电渗现象高浓度凝胶难剥离五.电泳技术在药物分析中的应用

药典中的收载情况英国药典：

1975年版开始将电泳收载入附录,1980版、1993版将电泳方法增加到6种,1998年版又对自由移动界面电泳作了详细说明美国药典：

1985版起开始将电泳收载入附录,并对凝胶电泳的原理、影响因素作了详细的说明,NF22册又增加了DESK电泳。中国药典：

1990年版二部首次收载入附录中，1995年版、2000年版、2005年版将电泳中的五种电泳技术(纸电泳法、醋酸纤维素薄膜电泳法、琼脂糖凝胶电泳法,聚丙烯酰胺凝胶电泳法、SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳法、免疫电泳法在附录中规定下来,并对高效毛细管电泳也作了详细的说明。1.纸电泳法(paperelectrophoresis)纸电泳法：是用滤纸作为电泳支持介质的一种方法。特点：设备简单,应用广泛；电泳时间长,分辨率较差。应用：三磷酸腺苷二钠原料、三磷酸腺苷二钠注射液的含量的测定；胞磷胆碱钠有关物质检查。此外，在植物化学成份的分离中得以应用,如糖类,三萜类等可利用其衍生物的方法使其分子带电荷,再用纸电泳法进行分离。2醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳：是用醋酸纤维素薄膜作为电泳支持介质的一种方法。特点：电泳后区带界限清晰,分辨力强；通电时间较短；对各种蛋白质都几乎完全不吸附，无拖尾现象；对染料也不吸附；电渗作用虽高但很均一,不影响样品的分离效果,必须在密闭的容器中进行电泳,并使用较低压电流避免蒸发。

应用：《中国药典2005版三部》中人血白蛋白、人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白、2000版中人胎盘蛋白、人胎盘血免疫球蛋白中的蛋白质纯度测定。临床检验中已经广泛用于血清蛋白,血红蛋白,球蛋白,脂蛋白,糖蛋白,甲胎蛋白,类固醇及同工酶、尿蛋白等的分离分析以及免疫电泳等中，用于疾病的诊断。3聚丙烯酰胺凝胶电泳

(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)

聚丙烯酰胺凝胶电泳:

根据被分离物质所带的电荷多少及其分子大小、形状的不同，在电场的作用下，产生不同的移动速度而分离的方法。特点：具有电泳和分子筛的双重作用。重复性高,凝胶柱弹性好,无电渗作用,且设备简单,样品量少,分辨率高。应用：《中国药典2005年版二部》中胰岛素及中性胰岛素注射液的有关蛋白质检查

此外，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳还用于性别基因鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳法目前还广泛应用于分子生物学、生物化学、细胞学、微生物学、植物学、动物学、免疫学等学科的研究以及临床化验。4.琼脂糖电泳

琼脂糖电泳：是用琼脂糖作为电泳支持介质的一种方法。一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。

应用：判断扩增片断的大小；回收扩增片断，用于转印进行Southern印迹用于中药材的鉴别真伪、分辨优劣，中药材指纹图谱的研究等。

5.免疫电泳免疫电泳：把电泳技术与免疫扩散结合起来，基于抗原的电泳迁移以及与抗体的专一性免疫沉淀反应。在大部分电泳中，样品中的抗原通过含有相应抗体的pH8.6的薄层琼脂糖凝胶，抗原在pH8.6时通常带强负电，而抗体在此pH不带电，不能迁移动。抗原在含有抗体的凝胶中电泳时发生免疫反应。最初，抗原过量，所以仅产生可溶性的免疫混合物，与抗原一起向阳极移动，当抗体与抗原比例合适时就形成大的、不溶性的免疫沉淀。应用：中国药典三部中：人血白蛋白及各类免疫球蛋白的鉴别实验，均采用本方法。 可用于检查蛋白质制剂的纯度，研究抗血清制剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体，检验两种抗原是否相同等。

6高效毛细管电泳法

(highperformancecapiaryelectrophoresis,HPCE)高效毛细管电泳法:根据离子在缓冲液中迁移的速度与电场呈正比原理,将凝胶电泳解析度和快速液相色谱技术溶为一体,是继高效液相色谱法出现后分析科学领域的又一次革命。特点：“三高二少”，即具有高灵敏度、高效快速、高分辨率,用量少、成本低等优点,可方便地连续洗脱样品。HPCE的分类

毛细管区带电泳（CZE）毛细管凝胶电泳（CGE）

胶束电动毛细管色谱（MEKC,

HPCE

MECC)