核因子-b受体活化因子配体在人类根尖肉芽肿和根尖囊肿组织中的表达

核因子-b受体活化因子配体在人类根尖肉芽肿和根尖囊肿组织中的表达

慢性根尖炎是一种常见的上颌骨性疾病。主要病理类型包括根尖肉芽肿和根尖囊肿。其重要病理学特征之一是炎症性骨吸收,这与局部破骨细胞的形成和功能关系密切。近年来新发现的核因子-κB受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactorκBligand,RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)在介导破骨细胞分化和活化的过程中,分别是重要的正性和负性细胞外调节因子。RANKL和OPG在骨破坏性疾病中的研究已成为骨代谢研究的热点。而这两个新因子在慢性根尖周病损骨吸收机制中的作用研究较少。Sabeti等采用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)方法,对21个人类根尖周病损组织中的RANKLmRNA进行了检测,结果所有样本中均有表达。张晓磊等在大鼠实验性根尖周病变过程中观察到了RANKL表达的动态变化。本研究采用免疫组织化学方法,检测RANKL和OPG在根尖肉芽肿和根尖囊肿病损组织中的表达。旨在探讨RANKL和OPG在慢性根尖周炎骨质破坏中的作用。1数据和方法1.1研究对象的选择在2004年6月至2007年6月北京大学口腔医院病理科存档的石蜡标本中,选取病理诊断为根尖肉芽肿和根尖囊肿各20例,复习HE染色切片。临床收集6例因正畸拔除的健康牙齿牙周膜组织作为正常对照组,制备石蜡标本。所有研究对象(包括患者和健康人)均签署了知情同意书。实验共分3组:根尖肉芽肿组(20例)、根尖囊肿组(20例)和健康牙周膜组(6例,正常对照组)。分别将石蜡标本制作成4μm厚的连续切片,裱于经APES处理的防脱玻片中。1.2免疫组化法1.2.1主试剂小鼠抗人RANKL和小鼠抗人OPG单克隆抗体均购自R&D公司。两步法Envison免疫组化试剂盒和抗体稀释液均购自DAKO公司。1.2.2rakenl和opg对人工林表达的影响将石蜡切片脱蜡至水。用枸橼酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH6.0)在高温、高压下进行抗原修复,自然冷却。用3%(体积分数)过氧化氢室温孵育15min(用于封闭内源性过氧化物酶的活性)。滴加一抗RANKL(稀释度1∶100,4℃孵育过夜);一抗OPG(稀释度1∶300,4℃孵育过夜)。滴加二抗,室温孵育30min。用DAB显色,苏木精复染,脱水,透明,封片。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照,其余步骤同上。1.2.3阳性细胞表达阳性染色呈棕黄色或褐色颗粒。镜下,用盲法观察,先在低倍镜下观察整张切片,然后在高倍镜下每张切片选择10个视野,计数100个细胞/视野,取各视野阳性细胞表达的平均值为阳性细胞表达值。1.3数据统计分析实验数据以x¯±s表示,用SPSS13.0软件包处理数据。采用t检验和one-wayANOVA进行统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。2rakenl和opg在血管内皮细胞的表达RANKL阳性表达定位于细胞核内,少部分定位于细胞浆。RANKL多在浸润淋巴细胞上表达,成纤维细胞和浆细胞也有明显表达。OPG阳性表达主要位于细胞浆,少量在细胞核表达。OPG在淋巴细胞、成纤维细胞、多形核白细胞、浆细胞和增生的上皮细胞上都有表达,但RANKL和OPG在血管内皮细胞少有表达。以PBS代替一抗的阴性对照染色为阴性(图1,2)。与正常对照组相比,实验组根尖肉芽肿和根尖囊肿病损中的RANKL阳性细胞均明显增多,且RANKL/OPG的比率均明显增加,上述差异均有统计学意义。但RANKL表达和RANKL/OPG比率在根尖肉芽肿和根尖囊肿两组间的差异并无统计学意义。3组间OPG表达水平差异无统计学意义(表1)。3rakenl和opg对慢性根尖周炎组织的调节作用慢性根尖周炎多是由根管内细菌感染引起的局部炎症性疾病,常累及邻近牙槽骨和根尖部的牙骨质,使其吸收破坏。骨吸收是破骨细胞(osteoclast,OC)在成骨细胞参与下,侵蚀骨质的生物学行为。OC经增殖、分化、生存与融合发育为多核的成熟OC,再经活化成为功能性OC,其发挥骨吸收作用是一个复杂的多级调节过程。研究发现,迄今至少有30余种局部因子参与调节骨代谢。近年来对慢性根尖周炎的骨吸收的研究主要集中在免疫防御反应和细胞因子的作用两方面。研究认为白细胞介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumournecrosisfactoralpha,TNF-α)是人类根尖周病变中重要的骨吸收促进因子,可直接或间接参与骨吸收。Kawashima等的动物实验结果表明,IL-2和IL-12等是主要的促骨吸收因子,而IL-4和IL-10等因子是主要的抑骨吸收因子。此外,学者们对前列腺素过氧化物合成酶(cyclooxygenase-2,COX2),转化生长因子β1(transforminggrowthfactorbeta1,TGF-β1)和诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)等多种因子在慢性根尖周炎骨吸收中的作用进行了研究。然而,这些因子仅对OC形成和活化有协同作用。目前认为,OPG-RANKL和巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactor,M-CSF)是OC发生的基本条件,局部RANKL表达的改变才是直接促使OC分化的关键。RANKL与位于OC前体细胞膜上的受体——核因子-κB受体激活子(receptoractivatorofnuclearfactor-κB,RANK)结合,刺激OC分化,增强成熟OC活性,发挥骨吸收功能。而OPG作为RANKL的诱饵受体(decoyreceptor),与RANKL竞争性结合,阻断RANKL和RANK间结合,抑制OC分化,抑制成熟OC的骨吸收活性并诱导其凋亡。在OC的形成、活化过程中,RANKL和OPG分别是重要的正性、负性细胞外调节因子,过量RANKL促进骨吸收,过量OPG则抑制骨吸收。RANKL/RANK/OPG系统是近10年来发现的影响OC分化、发育、功能调节的最重要信号通路,是全身因子和局部因子调节骨代谢的共同通路。几乎所有的骨破坏疾病都是由于这一系统的平衡紊乱所致。本研究显示,与健康牙周膜组织相比,慢性根尖周病损组织中的RANKL表达明显增多,RANKL/OPG比率显著上升,这与牙周炎和类风湿性关节炎等骨破坏性疾病的研究结果相一致。此外,3组中的OPG表达水平的差异无统计学意义。慢性根尖周炎病损组织中的RANKL表达升高,而OPG表达无明显变化,打破了正常组织中的微环境平衡,促进OC分化,引起骨质破坏。根尖周病损组中绝大多数样本的RANKL表达明显强于OPG表达,仅有1例根尖肉芽肿和1例根尖囊肿中的OPG表达略高于RANKL,表明这2例病损组织中的骨吸收可能受到抑制。此外,正常对照组中RANKL的少量表达可能与正常根尖周牙槽骨组织的生理性骨代谢活动有关。分组研究表明,根尖肉芽肿组的RANKL和OPG表达均略强于根尖囊肿组,但差异并无统计学意义,且RANKL/OPG的比率在两组间的差异也无统计学意义。这些与Menezes等2006年的研究结果基本一致。分析原因可能是根尖囊肿处于根尖病损发展的相对稳定阶段,其免疫反应和骨代谢的活跃程度可能相应降低。本研究观察到在病损组织中有较多淋巴细胞浸润,RANKL多在淋巴细胞表达。但有所不同的是,Menezes等通过免疫组化检测,认为RANKL主要在根尖周病损组织的巨噬细胞中表达。Metzger等认为活化T细胞和活化巨噬细胞是参与根尖周炎骨吸收的主要细胞。活化巨噬细胞是诱导和产生骨吸收性细胞因子(如TNF-α和IL-1)的主要细胞。Arron等于2000年提出了“骨免疫学”(osteoimmunology)概念,正常免疫状态下,OC的分化和活化主要依赖于成骨细胞,但在免疫系统被激活的状态下,活化T细胞可表达RANKL,并通过相同途径诱导OC成熟和活化,直接参与病理性骨吸收活动。Kawai等推测T、