基于snp基因分型技术的近交系大鼠遗传检测

基于snp基因分型技术的近交系大鼠遗传检测

目前，实验动物的常用遗传检查方法包括生化方法、免疫分析和生物学鉴定。生化方法是检测实验动物的相关蛋白表型的传统技术，免疫学检测方法需要制备特异性的单克隆抗体进行抗原抗体反应，分子生物学方法主要包括限制性片段长度多态性，微卫星标记，单个核苷酸多态性(SNP)等。生命科学的飞速发展，促使只有不断的寻求更加简便、快速的遗传检测方法，才能满足目前对实验动物遗传品质越来越高的要求。由于蛋白表型的差异是由基因组序列的差异决定的，从基因水平检测遗传改变更具准确性和可靠性。2004年美国Jackson实验室对近交系小鼠的235个SNP位点进行筛选，获取28个信息丰富的SNP位点，足以鉴别48种近交系小鼠。胡培丽等对4种国内常用近交系小鼠进行SNP研究，筛选出16个SNP位点进行遗传检测。大鼠主要组织相容性复合体(MHC)，是一类具有高度多态性、序列保守的基因群。相关研究显示MHC的多态性与免疫排斥、自身免疫高度相关，如变态反应性脑脊髓炎、关节炎、高血压、肥胖以及不育等。研究大鼠MHC上的SNP位点，筛选信息含量丰富的SNP，建立新的分子标记用于遗传分析和免疫学研究。单核苷酸多态性(SNP)是继限制性内切酶技术、微卫星DNA技术之后第三代分子标记，在基因多态性研究、基因图谱构建、性状和疾病连锁分析中具有重要作用。目前，SNP分型方法主要包括PCR-RFLP,PCR-SSCP，等位基因特异性PCR(AS-PCR)，直接测序及基因芯片等。本实验室新建立了高保真酶特异性检测SNP基因型技术，利用高保真酶的校正机制和硫代磷酸化修饰引物，进行单管双向特异性扩增，不同等位基因扩增片段不同，满足SNP检测时非此即彼的二元化分型效果，特异性强，重复性好。本研究使用新近建立SNP基因分型方法，对五种常用近交系和两种新品系大鼠进行基因水平多态性研究，以期能建立近交系大鼠SNP扩增遗传图谱，并确定新品系的基因型。1材料和方法1.1家越界类实验动物五种常用近交系大鼠:BN、F344、WKY、LEW、SHR。其中BN、F344、SHR引自北京国家啮齿类实验动物种子中心【SCXK(京)2005-0004】，WKY引自北京华阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2009-0007】，LEW引自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2006-0009】。两种新型近交系大鼠:MIJ和HFJ，为河北医科大学培育的近交系大鼠。1.2主要试剂和设备1.2.1保健酶、保健剂、聚乳酸酯、乳化试剂和质粒小量快速提取试剂盒饱和酚，氯仿，异戊醇，蛋白酶K,TakaraTaq酶等均购于北京全新拓达，高保真酶(Fermantas)，胶回收纯化试剂盒(Axygen)，质粒小量快速提取试剂盒(Axygen)，CloneJETTMPCRCloningKit(Fermantas)等购于北京经科宏达。1.2.2紫外图像分析PCR仪型号为Bio-RadMYCLCLER，核酸琼脂糖凝胶电泳仪型号为Bio-RadPowerParBasic，紫外图像分析系统型号为上海复日FR-200紫外与可见分析装置UV/WhiteAnalysis，紫外分光光度计型号为日本BioSpec-mini，台式冷冻离心机型号为HettichMikro22R。1.3方法1.3.1鼠尾基因组dna的提取无菌条件下，剪取大鼠鼠尾1～2cm，采取蛋白酶K消化和酚-氯仿粗提法提取鼠尾基因组DNA。紫外分光光度计测A260/A280=1.8-2.0，稀释样品使样品浓度调整为10ng/μL。1.3.2snp位点筛选在NCBI数据库和RatGenomeDatabase网站上初步查询大鼠20号染色体MHC所在的P12区上的SNP位点和RS号。通过进一步筛选，选定9个SNP位点进行研究。筛选的原则:一是不同的大鼠品系在一个SNP上存在差异;二是SNP位点尽可能选在基因编码区，即有义突变的位点。引物的特异性是决定PCR扩增的关键。设计引物时遵循以下原则:一是四个引物Tm值的差异不超过3℃，碱基长度差异不超过5bp;二是内部两个引物的3’末端定位到SNP位点，与不同的SNP基因型配对;三是设计两个外部引物与SNP位点的距离相差100bp以上。1.3.3ss-pcr反应反应体系:10×PCRbuffer(Mg2+)2.5μL,dNTPMix(2mmol/L)2.0μL,P1、P2(10pmol/μL)各0.5μL,SP1、SP2(10pmol/μL)各0.75μL,DNA模板(约10ng/μL)2μL,PFU聚合酶(2.5U/μL)0.2μL。在每个体系中均设立阳性对照，即只加P1、P2引物各0.5μL，不加SP1、SP2，用灭菌超纯水补齐体系。反应条件:94℃预变性3min,94℃1min，退火温度1min,72℃1min,35个循环，72℃延伸8min。取PCR产物5μL在1.5%琼脂糖凝胶(含EB)上电泳35min，紫外图像分析系统上分析结果并拍照。1.3.4质粒提取与鉴定用琼脂糖DNA回收纯化试剂盒回收纯化PFU扩增目的片段，然后采用CloneJETTMPCRcloningkit试剂盒使目的片段连接于平末端载体，转化入DH5α感受态细胞，涂布于氨苄抗性的固体培养基培养过夜，挑取单克隆菌落摇菌培养过夜，提取质粒并经BglΙΙ酶切验证后送上海生工生物工程有限公司测序。2结果2.1ssnp位点筛选对五个近交系大鼠(BN、F344、WKY、LEW、SHR)的9个SNP位点进行了检测，虽然某些位点存在引物二聚体和错配杂带现象，但仍然不影响SNP检测结果。琼脂糖凝胶电泳图谱(图1)显示出五种大鼠在9个SNP位点上扩增条带特异且单一，且扩增目的条带与预期大小一致，表明等位基因型为纯合型。通过观察，五种大鼠在9个SNP位点上均显示出多态性，且易于辨别。以SNP位点RS13448591为例(如图2)，五种大鼠品系在同一位点上显示出多态性，即BN,WKY的目的条带约为153bp，对应的等位基因型为AA;F344、LEW、SHR的目的条带约为585bp，对应的等位基因型为GG。2.2pcr扩增目的检测电泳结果如图显示(图3)，虽然某些位点存在二聚体和错配杂带现象，但仍然不影响SNP检测结果，通过观察对比，发现MIJ大鼠和HFJ大鼠在9个位点上扩增目的条带一致，且均显示为纯合型。根据不同目的条带代表不同的等位基因型的原则，即可推断出MIJ、HFJ大鼠在9个SNP位点上的基因型，同时MIJ、HFJ基因型结果需经测序验证。2.3聚合型大鼠遗传基因型的筛选使用VectorNITSuite8序列比对软件，比对高保真酶(Pfu)扩增的目的条带测序结果，显示七种大鼠品系在9个位点SNP等位基因型与RatGenomeDatabaseSNP数据库提供的基因型数据一致，验证结果的可靠性。以RS13448591位点为例(如图4)，测序显示在此位点处BN、WKY、LEW的等位基因型为AA,SHR、F344、MIJ、HFJ的等位基因型为GG。根据PCR扩增图谱和测序结果，绘制出七种近交系大鼠在9个SNP位点上的遗传基因图谱(表1)。其中，BN、F344、WKY、LEW和SHR在9个位点上的基因型均为纯和子，且与RatGenomeDatabaseSNP数据库中信息一致。MIJ和HFJ作为新培育品系，数据库中缺乏SNP位点的信息，通过PCR图谱比对和测序结果验证，确定其9个SNP位点上的等位基因型，且均为纯和子。3单核苷酸多态性遗传检测单个核苷酸多态性(SNP)是由于单个核苷酸之间的差异而引起的遗传多样性，具有密度高、代表性、遗传稳定性等特点，全面地反映基因组的遗传及变异情况。目前，国内近交系大鼠的遗传检测方法主要为生化标记分析法，是通过检测同工酶或异构蛋白推测相应的基因分型，存在准确度及灵敏度低，反映遗传概貌有限等弊端。本研究基于新建立的高保真酶特异性检测SNP基因型技术，对位于大鼠MHC基因所在20号染色体P12区9个SNP位点进行研究，得到五种近交系大鼠(BN、F344、WKY、LEW、SHR)的SNP基因分型遗传图谱和同步的电泳图谱，进一步完善了这五种近交系大鼠分子标记的遗传标准的建立。通过对目的片段的序列测定考察该PCR技术的可靠性，测序结果其SNP位点等位基因均与RatGenomeDatabaseSNP数据库一致，验证了该方法准确可靠。同时，该方法扩增稳定，重复性好，使用高保真酶(PFU)以提高特异性，电泳结果条带显示清晰特异，能够简单快速的考察不同品系的同一位点的多态性现象。刘军须等应用近交系大鼠生化标记和分子生物学标记对MIJ和HFJ大鼠进行研究，显示11个生化位点完全纯合，且两个品系大鼠生化遗传概貌完全一致，同时对MIJ和HFJ大鼠进行随机引物扩增多态性的研究中发现两种新品系之间未发现多态性，而与其他品系之间存在多态性。本研究中对两个新品系大鼠进行SNP分析研究，确定了MIJ和HFJ大鼠在9个位点的基因型，进一步完善了新品系的等位基因信息，为进一步开发和利用新型动物品系提供了实验依据。MIJ和HFJ大鼠来源于同一对Wistar大鼠，尽管在生殖系统功能的特性表现有显著差异，但在对其进行基因组水平进行SNP研究时并未发现二者具有多态性。饲养条件、饮食生活方式的一致性大大排除外在环境对其功能变异的影响。转录翻译水平上及表观遗传学上的变异可能是影响亲本来源相同的两个子代出现了生殖功能显著差异的原因。对此，寻找基因组水平上的差异、转录翻译水平上的上调、下调及研究表