基于ril群体的抗绿豆象基因检测与分析

基于ril群体的抗绿豆象基因检测与分析

豆象是对豆类和其他豆类植物的严重警告，主要包括绿色豆象、三叶豆象和灰豆象。其中，绿色豆象和四状豆象受到的破坏最大。在绿豆1个生活周期内,因豆象危害可损失产量30%～56%,如再次侵染危害更重,甚至整仓绿豆受损。选育抗豆象绿豆品种是防治豆象危害的最佳途径。20世纪80年代以来,日本、泰国、澳大利亚等国的食用豆类遗传育种学家致力于抗豆象基因的发掘和利用。目前筛选出的抗豆象绿豆基因资源主要有马达加斯加野生种TC1966、印度栽培种V2709、菲律宾栽培种V2802和澳大利亚野生种ACC41。TC1966高抗绿豆象和四纹豆象,是研究最多的抗源。早在1988年,就有研究表明TC1966对豆象的抗性由显性单基因控制,并用于分子标记作图和抗性育种。V2709和V2802均抗绿豆象和四纹豆象,抗性均由1个主效显性基因控制,且很可能在同一位点。目前,还未见有关绿豆抗豆象QTL分析的研究报道。Kaga等利用饭豆和小豆杂交的中间作图群体在第2连锁群上检测到1个抗绿豆象主效QTL。Somta等利用栽培饭豆[Vignaumbellate(Thunb.)Ohwi&Ohashi]与野生小豆[Vignanakashimae(Ohwi)Ohwi&Ohashi]杂交F2代作图群体,对不同发育时期的绿豆象和四纹豆象进行动态QTL检测和遗传效应分析,结果在第7连锁群上检测到1个稳定的抗绿豆象主效QTL,在第3连锁群上检测到1个稳定的抗四纹豆象主效QTL。重组近交系经过多代连续自交,家系内基因型基本纯合,以近交系内一定数目的单株表现平均值作为该近交系的表现型值,可获得相对准确的表现型数据,适合多环境重复试验,是QTL定位的理想群体。为了在绿豆中寻找抗绿豆象基因,本试验以Berken/ACC41获得的重组近交系群体为材料,通过室内人工接虫鉴定,评价其对绿豆象的抗性表现,结合分子标记连锁图谱,进行绿豆象抗性QTL的检测和遗传效应分析。1材料和方法1.1群体材料的选择母本Berken(Vignaradiatassp.radiata)由美国俄克拉何马州立大学JamesKirby博士培育,对豆象高感(100%感);父本ACC41(Vignaradiatassp.sublobata)是1984年澳大利亚Lawn博士在昆士兰州的萨默塞特奥马镇(经度152°33′,纬度27°7′)发现的1个野生绿豆材料,为多年蔓生类型,茎秆纤细,农艺性状与栽培绿豆有很大差异,对豆象高抗(100%抗)。从Berken/ACC41亚种内杂交F2代开始,利用单粒传方法得到包含227个F8家系的RIL群体。为保存种质,在保证家系内种子质量和群体结构仍为随机群体的情况下,分别选取2000年在澳大利亚大田收获的2个重复各为210个和217个家系的F8RIL群体为试验材料。并于2005年将其中1个重复的210个F8RIL分别在北京及南京种植收获F9RIL群体。由于受天气和土壤因素的影响,有些家系出苗不齐,还有些家系对光温反应敏感,未能正常开花结实,北京和南京获得完整试验结果的家系数较少,分别为72个和59个家系,因此只将北京和南京材料作为参考。种植地点和接虫时间的不同组合构成4个环境处理,即:澳大利亚2005,澳大利亚2006,北京2006和南京2006。1.2家系和种子种2000年2月,在澳大利亚昆士兰州的澳大利亚联邦科学与工业研究组织植物研究所(CSIROPlantIndustry)种植F7RIL群体,完全随机区组设计,3个重复,同一区组内,每个家系8粒种子,种成0.4m×0.4m的小区,在小区的每个顶角种2粒种子,小区间隔1m,30d后间苗,每个顶角剩1个植株,成熟时每个重复按小区分别收获F8家系的种子。2005年7月,将210个F8家系分别种植在中国农业科学院作物科学研究所(北京)和江苏省农业科学院蔬菜研究所(南京)试验场,每个家系40粒种子,完全随机区组设计,2个重复,每个区组内,每个家系20粒种子种成1行,行长1.5m,行距0.5m。成熟时每小区按家系分别收获10个单株的种子,剩余单株按家系混收。1.3收集绿豆象,放养抗虫鉴定2005年7月及2006年7月,从中国农业科学院作物科学研究所仓库内收集绿豆象,带回实验室用感豆象品种中绿1号种子饲喂,繁殖的豆象用于抗虫鉴定。1.4种子受害调查采用国家科技攻关项目选用的室内人工接虫方法。于2005年7月,将210个澳大利F8RIL及其亲本Berken和ACC41接虫;于2006年7月将217个澳大利亚F8RIL及在北京和南京分别收获的72个和59个F9RIL及其亲本Berken和ACC41接虫。2年接虫均用中绿1号作对照,设2个重复。从每个家系中随机选取60粒健康种子分成2份,每份30粒,分别放入直径6cm和高1cm的小塑料盒,不加盖放入大塑料盒(66cm×44cm×18cm),上盖2层黑布,置养虫架上。养虫温度控制在(27±2)℃,并保持黑暗和相对高湿。每个大塑料盒中放入400～500对刚羽化1～3d的成虫,平均每份被鉴定材料8对,令其随机产卵,至感虫亲本每粒种子着卵量约5粒以上时,除去成虫,将已接虫材料继续培养在养虫室。接虫40～45d后,当对照中绿1号种子受害率达100%时,调查每份材料的受害粒数,换算成种子受害率。公式为:SDR=ΣNSDN×100%SDR=ΣΝSDΝ×100%式中,SDR:种子受害率(%),NSD:受害种子数,N:鉴定种子总数。1.5最佳工艺条件的确定及显著性检测遗传连锁图谱的构建见文献。图谱中的79个RFLP分子标记均匀的分布于13个连锁群上。个体来源于ACC41染色体区段的占个体基因组的12.39%～74.34%,来源于Berken染色体区段的占个体基因组的25.66%～87.61%,ACC41基因占整个群体基因组成的43.70%,Berken基因占56.30%,χ2测验显示群体组成符合1∶1的分离比例(χ2=0.67<χ20.05,1=3.84),表明该群体是一个随机群体,适合进行QTL定位。在79个位点中,29个位点出现偏分离(1∶1),其中24个位点表现0.05水平的极显著偏分离(占30.38%),5个位点表现0.01水平的极显著偏分离(占6.33%),分布在除第7、8、10外的10条连锁群。这13条连锁群覆盖了绿豆基因组约684.7cM,其中最短连锁群5.6cM,最长连锁群85.9cM,标记间平均距离为10.4cM,最大距离为20.7cM。利用WinQTLCart软件进行复合区间作图(compositeintervalmapping,CIM)。CIM分析时应用Basten等模型6的向后逐步回归的方法,选择5个控制标记,窗口大小为10cM。用软件MapDraw绘制遗传图谱。将LOD值3.0作为出现QTL的检测标准,用这样的阈值在绿豆基因组中检测1个错误QTL的几率大约只有0.05。2结果与分析2.1抗豆象性状在环境间的分离和抗感两亲本Berken和ACC41抗性差异极显著,其中Berken在2005年7月和2006年7月接虫中种子受害率都为100%,而ACC41种子受害率均为0。由表1可见,RIL群体种子受害率在0～100%均有分布。在2005年7月接虫试验中,210个澳大利亚RIL种子受害最轻,平均受害率为52.55%±42.06%;2006年7月接虫试验中,217个澳大利亚RIL种子平均受害率与2005年7月接虫的210个澳大利亚RIL种子平均受害率接近,为52.99%±46.72%;72个北京RIL种子受害最重,平均受害率为75.93%±36.32%;59个南京RIL种子受害程度居中,平均受害率为62.04%±41.73%。由图1可见,4个环境条件下RIL群体的抗豆象性状均表现偏分离。以50%为界限,将RIL按性状值分为2组,即抗(受害率≤50%)和感(受害率>50%)。家系数经卡平方适合性测验结果表明,除北京2006RIL群体抗∶感不符合1∶1分离比例外(χ2=10.56>χ20.05,1=3.84),其他3个环境下的RIL群体抗∶感均符合1∶1的分离比例,(澳大利亚2005RIL群体,χ2=2.29<χ20.05,1=3.84;澳大利亚2006RIL群体,χ2=0.23<χ20.05,1=3.84;南京2006RIL群体,χ2=2.75<χ20.05,1=3.84),说明Berken和ACC41组合存在主基因的分离,适合用来进行基因定位。2.2抗绿豆象各微量元素的遗传多样性应用WindowsQTLCartographer2.0对4个环境条件下的RIL群体进行QTL检测和遗传效应分析。结果表明,在4个环境条件下,RIL群体均在第9连锁群上mgM213～VrCS161标记之间检测到1个抗绿豆象QTL,其LOD在12.99～82.74,解释表型变异的74.05%～79.27%,距离左翼标记mgM213的距离为4.0～8.0cM。该QTL的加性效应为负值,表明来自母本Berken的该位点等位基因可增加种子受害率的40.75%～45.18%,即抗性等位基因来自父本ACC41(表2,图2)。按照Humphry对QTL的命名方法,将位于第9连锁群的该QTL命名为BrI(图3)。3个环境条件下ril群体克氏原螯虾种子基因座和抗绿豆象基因对其抗性和基因变化作用豇豆属食用豆类是亚洲、非洲等许多国家的主要粮饲作物,但豆象对豇豆属作物的危害非常严重,培育抗豆象品种是减少危害最经济有效的方法。TC1966是最受各国重视的抗豆象绿豆野生资源,但Miura等用TC1966和感豆象亲本“OsakaRyokutou”杂交后代材料B14F17饲喂小鼠,发现小鼠血液生物化学值发生变化,因此培育带有TC1966抗性基因的品种对人类的安全性还需进一步研究。本研究选用ACC41作为试验材料,以期为抗性育种提供新的抗豆象基因资源。本试验表明,RIL群体在4个环境下种子受害率均呈现偏分离,卡平方适合性测验显示除北京2006RIL群体外,其他3个环境下的RIL群体抗∶感均符合1∶1的分离比例,说明存在1个抗绿豆象的主效基因。QTL作图分析也表明4个环境条件下RIL群体都在第9连锁群mgM213～VrCS161标记之间检测到1个抗绿豆象基因座,特别是北京和南京分别收获了72个和59个家系,其理论上已不是随机群体,尽管如此,也在该区域检测到抗绿豆象基因,表明该基因座是1个对绿豆象抗性起重要作用的稳定表达的抗性基因位点。其在4个环境下解释的表型变异达到74.05%～79.27%,是抗豆象的主效QTL。多年来食用豆类育种学家研究认为豇豆属对豆象的抗性为单基因或寡基因遗传。黑吉豆对绿豆象的抗性由1个隐性基因控制;野生黑吉豆对四纹豆象的抗性由复基因控制;豇豆对绿豆象的抗性由2个隐性基因控制。不过Somta等认为栽培绿豆V2709和V2802对绿豆象和四纹豆象的抗性虽由1个显性主基因控制,但也存在抗性百分数呈现连续分布的数量遗传特点。本试验中4个环境条件下RIL群体种子受害率在0～100%呈现连续分布,也表明抗绿豆象有数量遗传特点。Young等的研究表明野生绿豆TC1966由1个主效基因控制,该主效基因解释表型变异的87%,还存在微效基因的作用,主基因和微效基因的总和才能解释表型的全部变异。本研究中BrI解释了表型变异的74.05%～79.27%,也说明还有一些微效QTL的存在,如果将LOD降到2.5以下,还能在其他连锁群检测到一些微效QTL。QTL分析还表明RIL群体在4个环境条件下检测到的主效QTLBrI与左侧标记间的距离均在10cM以下。因此,有必要在初级定位的基础上,使含有目标QTL的染色体