树突状细胞与肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞对荷瘤大鼠的免疫治疗效果

树突状细胞与肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞对荷瘤大鼠的免疫治疗效果

c型肿瘤（cd）是一种已知的抗原加工和脱生功能最强的独特的抗高血压细胞（apc），与肿瘤的发生、发展和预后密切相关。肿瘤组织中大量c浸润的患者预后好，而c-i患者预后差。本课题组前期的研究提示,DC在卵巢上皮癌宿主抗肿瘤免疫中发挥重要作用,且DC可诱导出特异性杀伤卵巢癌细胞的免疫效应。有关DC疫苗抗卵巢癌作用的研究进展缓慢,其中多数是体外研究,体内研究还处于探索阶段。我们的研究针对大鼠卵巢上皮低分化腺癌细胞株NuTu-19建立近交系大鼠Fischer344动物模型,利用这个免疫学研究的理想动物模型探讨肿瘤细胞裂解物致敏的DC对大鼠卵巢上皮癌的免疫治疗效果。1材料和方法1.1华西医科大学第二附属医院专科医生王和教授惠德国医生回国大学第二附属医院整形外科大学科大学第二附属治疗计划近交系Fischer344大鼠卵巢上皮低分化腺癌细胞株NuTu-19由华西医科大学第二附属医院妇产科王和教授惠赠。近交系Fischer344雌性清洁级大鼠购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心,许可证号:SCXK-(军)2002-001。1.2方法1.2.1去蛋白的pat-19细胞的体外输注将雌性近交系Fischer344大鼠30只,随机分为3组,分别在右腋皮下注射对数生长期的NuTu-19细胞,1×107/只。定期测量种植局部肿瘤体积(体积=1/6лab2,其中a表示纵径,b表示横径),并进行病理组织学观察。1.2.2肿瘤细胞裂解物taa将大鼠卵巢癌NuTu-19细胞进行复苏与传代,在对数生长期,调整细胞浓度1×108mL-1,反复冻融,高速离心(4600r/min×30min),上清液经0.22μm微孔滤膜过滤,获得肿瘤细胞裂解物(tumorassociatedantigen,TAA)。取培养第5天的未成熟DC,以DC与抗原的比例1∶10(抗原的量以冻融前肿瘤细胞的量计)加入TAA,DC的终浓度为1×107mL-1,继续培养,到第12天收获TAA致敏的DC:TAA/DC。1.2.3尾静脉辅助药物对三组已经荷瘤2周的大鼠分别用PBS、DC或TAA/DC进行治疗。1)PBS组:每只尾静脉注射0.2mLPBS,作为对照。2)DC组:每只尾静脉注射0.2mL1×107mL-1DC细胞悬液(含2×106个细胞)。3)TAA/DC组:每只尾静脉注射0.2mL1×107mL-1TAA/DC细胞悬液(含2×106个细胞)。观察大鼠一般状态、局部肿瘤的生长、转移情况及细胞免疫状态。1.2.4不同试剂对内源性过氧化物酶活性的影响EnVition二步法,采用PV-9000第2代通用型二步法检测系统。步骤如下:1)石蜡切片脱蜡至水;2)蒸馏水冲洗,PBS浸泡5min,EDTA高压修复;3)3%H2O2室温孵育10min,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2min×3次;4)滴加1∶60稀释的CK原液(兔抗大鼠)37℃孵育1h;5)PBS冲洗,2min×3次;6)滴加试剂1(polymerhelper),37℃孵育20min,PBS冲洗,2min×3次;7)滴加试剂2(polyperoxidase-anti-mouse/rabbitIgG),37℃孵育20min,PBS冲洗,2min×3次;8)PBS冲洗,2min×3次;9)显色剂显色(DAB或AEC);10)自来水充分冲洗,复染,脱水透明,封片。1.3统计处理所有数据用ˉx±s表示,统计用SPSSforWindowsVer.11.5软件,采用t检验及方差分析。检验水准α=0.05。2结果2.1围组织粘连,细胞异形肿瘤细胞接种大鼠5d后,在种植局部可触及到增生的结节,成瘤率100%,质地偏硬,与周围组织粘连,在进行免疫治疗前,肿瘤呈进行性增长。取肿瘤组织行HE染色后显示,发现局部增生的细胞异形性明显,分化程度低,腺体大小和形状不规则,排列紊乱,胞质嗜碱性(图1A)。免疫组化染色证明为上皮来源的肿瘤组织——细胞膜(细胞角蛋白),被染成棕黄色(图1B)。2.2治疗对大鼠体质量和局部肿瘤体积的影响荷瘤2周的大鼠,毛发发质粗糙、凌乱,行动迟缓,食欲下降,耳廓苍白。用PBS、DC或TAA/DC对其进行治疗过程中,三组大鼠体质量无明显差异,均无腹水出现。经TAA/DC治疗组局部肿瘤没有明显变化,P=0.355,DC治疗组局部肿瘤体积有增大,P=0.000;而PBS对照组局部肿瘤增长最明显,向周围组织浸润,P=0.000(表1)。2.3两组肿瘤细胞的异形性在治疗后3周分别将肿瘤切除,进行HE染色。PBS和DC治疗组肿瘤细胞的异形性仍然明显,而TAA/DC组肿瘤细胞趋向萎缩,腺腔由单层细胞构成,肿瘤细胞的异形性降低(图2)。2.4肺转移癌细胞转移率在治疗后8周解剖大鼠,发现PBS和DC治疗组均有肺转移,转移率100%,其中PBS组更加明显,肉眼可见,HE染色及免疫组化染色可以证实肺转移癌的存在,而TAA/DC组无转移灶出现(图3)。2.5不同荷瘤治疗前后cd8+t细胞配比变化在肿瘤细胞种植后2周,大鼠外周血的CD8+T细胞百分比明显下降,差异有统计学意义,P=0.000(表2)。对荷瘤2周后的大鼠治疗3周后,只有TAA/DC治疗组CD8+T细胞百分比增加,差异有统计学意义,P=0.000(表3)。但是在对大鼠解剖之前(8周时)CD8+T细胞的数量又有明显下降,P=0.000;与治疗前相比差异无统计学意义,P=0.309(表4)。3taa/dc在荷癌大鼠免疫治疗中的应用建立卵巢癌动物模型是研究卵巢癌病因学及治疗学的重要工具,目前有3种卵巢癌模型的建立方式:1)皮下移植瘤模型:以反映瘤细胞的增生性为主,便于实验观察;2)腹水移植瘤模型:以反映卵巢癌细胞种植在腹腔生长和腹水形成为特点,但缺乏卵巢实体瘤的表现,且不便于观察;3)原位移植瘤模型:更客观、真实地反映了卵巢癌的临床发展过程及肿瘤的生物学特征,但操作复杂,不便观察。我们的实验在考虑众多因素后,采用了皮下移植瘤模型。将对数生长期的卵巢癌细胞接种于大鼠右腋皮下,5d后在皮下可触及到增生的结节,质地偏硬,与周围组织粘连,成瘤率100%,在进行免疫治疗前,肿瘤呈进行性增长,提示卵巢癌动物模型建立成功。肿瘤免疫治疗可以激活机体自身免疫系统对抗体内肿瘤,其优势在于:严格的自体源性;极少的不良反应;不受肿瘤细胞的位置、类型以及增殖期的影响等。近年来的研究证明,用各种肿瘤抗原体外刺激DC,然后回输或免疫接种荷瘤宿主,可以诱导机体产生明显的抗肿瘤效应。我们的实验比较了TAA/DC、DC、PBS对荷卵巢癌的大鼠免疫治疗效果。结果显示,TAA/DC对荷瘤大鼠的免疫治疗作用明显强于DC治疗组及PBS对照组。主要表现在:1)TAA/DC在体内产生明显的抗肿瘤效应,抑制肿瘤生长,使肿瘤细胞向周围组织的侵袭能力下降;2)TAA/DC可改善荷瘤大鼠的一般状况,控制远处转移;3)TAA/DC可调节机体细胞免疫功能发挥抗肿瘤的免疫效应。肿瘤细胞种植于大鼠体内2周后与种植前相比,在细胞免疫中起重要作用的CD8+T细胞的百分比明显下降,差异有统计学意义,P<0.01,提示大鼠的细胞免疫功能降低。而经TAA/DC治疗3周后CD8+T细胞百分比明显上升,但具有时限性,在治疗8周时,CD8+T细胞百分比又有明显下降,达到治疗前水平。间隔一定时间的多次免疫治疗,有可能长时间的改善其细胞免疫功能,有利于肿瘤的治疗。我们的实验使用的TAA/DC疫苗展现出很好的免疫治疗效