实验动物基因工程研究进展

实验动物基因工程研究进展

目前，实验动物育种的研究非常活跃，取得了良好的效果。本文仅对国内外实验动物基因工程的研究作一综述,以供读者参考。1小鼠基因犯罪基因图谱就是研究基因组结构,查明染色体上基因序列。目前研究者们正在有计划地、大规模地对包括人类在内的重要生物体的全基因图谱进行测序与诠释。以期绘制出遗传连锁图、物理图、序列图和转录图等主要图谱。由Watson发起的人类基因组计划,经许多国家科学家的努力,人类的基因序列已被基本阐明。猪的基因图谱正由英、法、德、美等10个国家18个单位进行研究;牛的基因图谱以欧洲为主,由13个国家30个单位绘制;羊的基因图谱由新西兰和北欧共同研究;家禽由英、美、荷兰、以色列等国研究。20世纪80年代以来,小鼠基因图谱的研究取得了很大进展。在小鼠基因作图技术上有了突破性进展,如:①建立了种间回交绘图平台,由于杂交亲本之间遗传多态性程度很高,基本上任何一个基因都可在单位杂交中被定位。最常使用的亲本是C57BL/6J和musSpertus。现可供使用的种间回交绘图平台是JacksonLaboratoryInterspecific(JLIB)和EuropeanCollaborativeInterspecificBackcross。②90年代以来,应用微卫星DNA技术,鉴定了数量众多的简单序列长度多态性标记(SSLP),在小鼠,目前已有总数为6555个SSLP被定位。③在小鼠突变基因位点的定位与克隆方面,目前已有1000多个自发或诱发的小鼠突变基因位点被定位,这些突变的表型很多与人类疾病表型相一致,因此可用小鼠突变基因鉴定人类的同源基因。④在小鼠物理图谱研究上,已构建了小鼠YAC文库并已标出9787个标记位点,平均相邻两个标记位点之间的距离为300kb,每个YAC克隆平均含有820kb小鼠染色体DNA,所有YAC共覆盖了92%的小鼠基因组。⑤在小鼠转录图的研究中,现已得到40万条表达序列标签(EST)及其定位的信息,8000个基因被定位在染色体的相应位置。⑥小鼠基因组测序,由于小鼠基因组总长度接近于人类,其测序难度也接近于人类基因组测序。作为模式生物,小鼠基因组测序被作为人类基因组计划的内容之一,预计2003年可完成全序列图。2dna多态性分析的应用分子遗传标记是所有遗传分析的基础,是进行基因连锁分析、遗传图谱构建、基因定位、动物遗传育种及生物进化与分类研究中不可缺少的工具。随着限制性内切酶和DNA重组技术的出现以及分子生物学的飞速发展,遗传标记开始转向遗传物质-DNA分子。由于各种遗传信息都蕴藏在DNA分子中,生物性状间的差异在本质上是DNA分子的差异,因此DNA是最可靠的遗传标记。近10年来,在人类基因组计划(HGT)的推动下,分子标记的研究与应用得到了迅速的发展。自1980年Botstein首先提出利用限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)构建人类遗传连锁图以来,遗传标记的数量已不再成为限制因素。用于DNA多态性分析的技术相继被提出并得到广泛应用。在以分子杂交技术为基础的RFLP分子标记外,Jeffreys(1985)首先发现并建立了DNA指纹技术(DFP),此外还有可变数目串连重复位点(VNTRs)多态性分析、单位点小卫星多态性分析等。近年来又发展了以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础的遗传标记方法,诸如:随机扩增多态性DNA(RAPD,Williams,Welsh,1990)、序列靶标位点(STS,Olson,1989)、微卫星DNA(亦称简单重复序列,SSR,Litt&Luty,Weber&May,1989)、扩增片段长度多态性(AFLP,ZabeauMarc,VosPieter,1992)等。上述技术被广泛应用于实验动物的遗传检测、亲子鉴定、品种(系)的遗传纯度及遗传距离的测定、重要经济性状的遗传标记、群体遗传变异分析、动物的起源与亲缘关系分析、标记辅助选择(MAS)等方面。同时,在基因制图、连锁分析、基因定位和遗传病诊断等方面也得到广泛应用。Jeffreys(1987)采用33.6和33.15为探针检测了6个近交系小鼠及野生家鼠的DFP;Sudo等(1993)对实验兔进行了DFP分析;Woodward等(1994)用481条引物检出近交系小鼠95个RAPD多态位点,结合重组近交系分析,构建了含有76个多态标记的遗传图。目前已发现近交系大鼠微卫星位点8000多个,每一个微卫星位点都具有1~10个等位基因。我国实验动物界也广泛采用DNA标记技术开展了实验动物的遗传检测及遗传特征分析,如:董罡等(2000)用JL-02多位点探针对近交系小鼠DFP进行了分析,李瑞生等(2001)进行了DFP、SSR在近交系大鼠遗传检测的应用研究。在RAPD方面,先后开展了西双版纳小型猪、巴马小型猪、贵州小型猪、10余个小鼠品系、兔的RAPD研究;此外,对贵州小型猪的AFLP、小型猪的SSR也进行了研究。研究结果显示,分子遗传标记技术在实验动物中具有广阔的应用前景。3动物模型的开发实验动物基因组的改造与操纵,能够制备具有各种用途的动物模型,已成为生命科学研究中十分重要的技术平台之一。小鼠基因组的改造与操纵目前已取得了明显进展。3.1基因组织特点基因剔除(geneknockout)是指通过同源重组原理,向ES细胞内源基因引入特定的突变(点突变、缺失、转位、倒位、全突变),使靶基因功能丧失或部分丧失。这种特定的突变可通过生殖系传递下去。自1990年起,发达国家十分重视基因剔除小鼠技术。一旦某种人类疾病基因被克隆成功,便可制备相应的基因剔除小鼠,从而对该基因的功能和作用途径进行研究。目前许多基因剔除小鼠被用作人类疾病模型。我国先后从国外引进了BALB/c—HSF1和Smad3基因剔除小鼠,并对其引种、保种、繁殖特性、基因型鉴定、遗传稳定性等进行了研究。3.2小鼠人源染色体区域采用转大片段DNA技术,用人的染色体片段取代小鼠相应的染色体区域。这种含有人源染色体片段的小鼠即可称为“人化小鼠”。人化小鼠具有广泛的用途,如:遗传功能分析、模拟人类染色体疾病、制造特定的基因产品等。3.3实现资源共享与小鼠疾病模型相关的一系列生物信息数据库已经建立,因此只要建立网络平台,在网上就可进行许多工作。这类研究的对象被称作“电子小鼠”。目前有很多“电子小鼠”的数据库,如:美国有Jackson实验室的“小鼠基因组数据库”、“小鼠基因组百科全书”、“基因表达数据库”、“人类孟德尔遗传在线”、“小鼠突变体资源库”、“定位突变数据库”等,英国有“小鼠细胞遗传图谱”、“啮齿类基因组数据库”、“畸形小鼠同源数据库”等。通过互联网就可实现资源共享。此外,数量性状定位(QTL)、诱变技术等也在实验动物中广泛应用。4sv0cda的基因表达在小鼠精子外源基因中的表达转基因技术(transgenictechnique)是基因工程与胚胎工程结合的一门生物技术。转基因动物生产是使用基因工程技术将选定的目的基因导入动物染色体组上,整合并表达和遗传的过程。携带和表达外源基因的动物称为转基因动物(transgenicanimal)。转基因动物的生产过程包括目的基因的构建、基因的转移、基因的整合及表达等。将目的基因导入动物基因组的方法有原核注射法、反转录病毒介导法、胚胎干细胞法、精子介导法、卵母细胞质注射法、发生泡基因注射法、基因粒子枪法等。美国科学家Jaenisch(1974)最早把猿猴病毒40(SV40)注入小鼠囊胚腔得到部分体组织中含有SV40DNA的嵌合体小鼠,1976年他们利用反转录病毒与小鼠卵裂球共培养把莫氏白血病病毒基因插入小鼠基因组,建立了世界上第一个转基因小鼠系。1980年,Gordon等把SV40DNA显微注射到小鼠受精卵的原核中,获得了两只转基因小鼠,创建了显微注射转基因方法。1982年,Palmiter和Brinster用显微注射法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵中,获得了体重是对照组小鼠2倍的“超级鼠”,首先证明外源基因可在受体表达,并且表达产物具有生物活性。从此,转基因技术受到生物学界的广泛重视并得到迅速发展。至今已制备出转基因小鼠、大鼠、兔、鸡、鱼、牛、猪、羊等多种动物的转基因品系。我国从20世纪80年代初期开始转基因动物研究,先后成功地将人β-球蛋白基因、大肠杆菌galk和gpt基因、牛及人生长激素基因导入小鼠受精卵中,获得了多种转基因小鼠。近年来,采用大片段DNA导入技术制备转基因小鼠亦有报道。如,转YAC、BAC和PI小鼠,转染色体小鼠等。近年来,转基因动物被用来非活性蛋白或用外分泌器官生产活性蛋白。1987年,Simons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的β-球蛋白,1988年又从转基因绵羊乳汁中得到了α-抗胰蛋白酶。后来,抗凝血因子Ⅸ(Clayk等,1989)、组织纤维蛋白溶酶原激活因子(TPA)(Ebert等,1991)、蛋白质C(Velander等,1992)、凝血因子Ⅷ(Halter