大黄素对大鼠肝移植后肝细胞凋亡的影响

大黄素对大鼠肝移植后肝细胞凋亡的影响

大黄素是一种化学品（1、3、8-三羟基-6-甲基）1、3、8-三羟基色胺-6-methylanthraquinoe）。已通过研究证实了其能延长非同系大鼠间原位肝移植的术后成活时间,降低移植肝的排斥活动指数(rejectionactiveindex,RAI),并和抗排斥反应药物环孢素A(CsA)有一定的协同作用。研究表明,移植肝排斥反应和细胞凋亡具有密切的正相关性,抗排斥反应药物可有效地降低移植肝的肝细胞凋亡。因此,为了进一步证实大黄素对肝移植排斥反应的抑制作用,利用近交系大鼠原位肝移植急性排斥模型,研究了大黄素对移植肝细胞凋亡的影响。1材料和方法1.1大鼠受体bn近交系Lewis(简称LEW)大鼠作为供体,体重200～250g,近交系BrownNorway(简称BN)大鼠作为受体,体重220～280g。供受体均为雄性,购自北京动物实验中心,合格证号SCXK(京)2007-0001,供体体重略小于受体20～30g,饲养条件为SPF级。1.2北京市第20060线大黄素粉剂(西安华萃生物技术有限公司,批号SH20060612)。细胞凋亡原位检测(Tunel检测)试剂盒及相关的染色试剂购自福建迈新公司。1.3方法1.3.1原位肝移植动物模型以Kamada双套管法建立LEW→BN大鼠原位肝移植动物模型。随机分为4组,以存活时间大于3d作为移植成功的标准,最终每组6只动物。1.3.2两组术后给药情况模型大鼠分别设A组(排斥反应组)、B组(CsA组)、C组(大黄素组)、D组(CsA+大黄素组)。每组术后每天腹腔给药,分别为生理盐水0.5mL·d-1,CsA10.0mg·kg-1·d-1、大黄素50.0mg·kg-1·d-1、大黄素50.0mg·kg-1·d-1+CsA10.0mg·kg-1·d-1。连续用药8d,停药7d后经麻醉处死各组大鼠,取肝脏组织行常规石蜡包埋。1.3.3急性排斥反应将蜡块切片,HE染色,观察各组大鼠移植肝组织病理学变化以确定急性排斥反应(acuterejectionreaction,ACR)程度。1.3.4凋亡细胞tunel法检测肝凋亡细胞比例将蜡块切片,按原位细胞凋亡检测试剂盒所示步骤逐步操作,行凋亡细胞Tunel法(原位末端标记法)染色,观察各组移植肝凋亡细胞比例以确定AI。1.4统计处理所得计量数据以x¯±sx¯±s表示,应用SPSS12.0软件包进行统计分析。2结果2.1肝脏水肿、粘连,注药时总时看时肝脏自由基各组存活超过3d的大鼠均能活过8d,但A组大鼠术后状态差,注药时反应渐迟钝,8d内体重逐渐下降无回升,解剖后见肝脏有肿胀、粘连。另3组大鼠术后较A组明显活泼,注药时反应敏捷,第5天起体重即开始回升,解剖后见肝脏基本正常。2.2大鼠肝组织排斥反应及rai发生率比较移植肝术后急性排斥反应程度采用Banff分级方案,对汇管区炎症、胆管炎症、静脉内皮炎症依其轻、中、重程度分别计为1,2,3分,最后三者相加确定排斥活动指数(RAI)。在HE染色切片上看,A组大鼠肝组织排斥反应严重,汇管区大量炎性细胞浸润,胆管内皮有坏死(图1);B,C组大鼠排斥反应明显减轻,汇管区有炎性细胞浸润,胆管内皮基本完整(图2,3);D组大鼠肝组织汇管区少有炎性细胞,汇管区完整(图4)。A,B,C,D组RAI分别是7.67±0.98,5.17±0.40,5.83±0.75,3.83±0.75。以各组RAI的原始数据输入SPSS软件行4个样本均数两两比较的q检验,结果见表1。从统计结果可知,A组RAI值与B,C,D比较差异有意义,D组和B,C差异也有意义,而B,C组间差异无统计学意义。2.3凋亡细胞tunel高倍镜下随机选取视野清点400个肝细胞,统计其中凋亡细胞阳性率,即AI。在Tunel染色片上可以观察到A组大鼠的肝脏组织切片上凋亡细胞大量存在(图5),而B,C组相对较少(图6,7),D组仅少量分布(图8)。光镜下凋亡细胞(Tunel阳性细胞)判断依据是:细胞核呈蓝黑色显色,核多小于正常肝细胞核,可伴有核周空晕(图8)。A,B,C,D组AI分别是35.83±2.32,15.83±1.33,16.50±2.35,11.50±1.05。以各组AI的原始数据输入SPSS软件行4个样本均数两两比较的q检验,结果见表2。从统计结果可知,A组AI值与B,C,D比较差异有意义,D组和B,C差异也有意义,而B,C组间差异无统计学意义。3大黄素有效降低移植肝移植术后细胞凋亡,并影响其活性近交系大鼠具有遗传背景明确、生物学特性资料详细等优点,实验时重复性好,实验所需的动物数量也可相对减少,实验结果较封闭群大鼠如Wistar→SD的可靠。文献报道,近交系大鼠LEW→BN原位肝移植模型是较可靠的急性排斥模型,术后会出现明显的急性排斥反应,生存质量差,生存期较短,移植肝病理观察可见典型的排斥反应表现。本研究中A组大鼠术后未经抗排斥药物处理,一般状态和组织学观察结果如上所述,与文献报道的结果相符。由于LEW和BN大鼠在国内已有供应,所以应常规作为肝移植急性排斥的模型应用。Banff分级方案是国际移植学会制订的肝移植术后急性排斥反应组织病理学诊断标准。该方案设定RAI总积分为9分,RAI小于3分为非确定型ACR,3～5分为轻度ACR,5～7分为中度ACR,7～9分为重度ACR。本研究结果显示,在近交系大鼠LEW→BN肝移植模型上,A组大鼠未经抗排斥药物处理,其ACR为重度,经大黄素及CsA处理的B,C组ACR为中度,二者合用的D组为轻度。统计处理结果显示大黄素能有效降低移植肝的ACR,合用CsA效果更明显,所以可认为大黄素有抗大鼠肝移植排斥的作用,且和CsA有协同作用,与本课题组先前在封闭群大鼠Wistar→SD肝移植模型上得到的结果相符。细胞凋亡是生物机体为了维持内环境的稳定,由基因控制的细胞自主性的程序性死亡,在全身免疫和器官移植中排斥反应起着重要的作用。研究证明,肝细胞凋亡是肝移植术后肝细胞死亡的一种重要方式,肝移植术后的排斥程度和肝细胞凋亡具有显著的相关性,排斥反应较重的移植肝的肝细胞AI较高,经有效抗排斥药物如CsA处理的移植肝排斥反应减轻,AI也降低。本研究中,ACR最明显的A组AI也最高。B,C组ACR为中度,其AI较A组明显降低,ACR最轻的D组AI也最低。所以,本研究也证实了排斥程度和肝细胞凋亡的相关性。同时,本研究还观察到单独应用大黄素的C组肝细胞AI为16.50±2.35,较未经抗排斥药物处理的A组(35.83±2.32)有明显的降低(P<0.01),和CSA处理的B组(15.83±1.33)差别无统计学意义,且合用大黄素和CsA能使移植肝的AI降低更为明显。所以,统计结果显示应用大黄素可有效降低移植肝的细胞凋亡,效果和CsA相当,二者合用的效果更明显。因此,本研究结果证实大黄素能有效降低大鼠肝移植后肝细胞的凋亡率,减轻术后的移植排斥反应,且和CsA有一定的协同作用。体外实验证实,大黄素对脂多糖刺激下单个核细胞释放细胞因子有显著抑制作用,还能抑制由内毒素诱导的肿瘤坏死因子α(TNF