陆地棉遗传图谱构建中的i-isj标记

陆地棉遗传图谱构建中的i-isj标记

0陆地棉遗传图谱的构建[研究意义]棉花是世界上最重要的天然材料。棉属51个种只有4个种可生产纺织用纤维，其中四倍体陆地棉（GosspiumhirsutumL.）占世界棉花产量的90%左右。如何实现高产、优质、多抗一直是棉花育种的重要目标。传统的遗传改良方法在棉花品种改良中起到了非常重要的作用。但由于棉花产量、纤维品质、抗病等性状多为数量性状，易受环境影响，因此育种周期长、效率低。现代分子标记研究为数量性状遗传改良提供了一种快速有效的方法。利用与数量性状基因（quantitativetraitloci,QTL）紧密连锁的分子标记对数量性状进行分子标记辅助育种，可大大提高育种效率。进行分子标记辅助选择，首先需构建遗传连锁图谱，在此基础上，结合数量性状的表现定位数量性状QTL。自Reinisch等构建第一张棉花种间RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism）遗传连锁图以来，利用RFLP、AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism）、SSR(simplesequencerepeat）和SRAP(sequencerelatedamplifiedpolymorphism）标记，已有研究人员利用海岛棉与陆地棉种间杂交群体，构建了相对饱和的棉花种间遗传连锁图，并定位了大量产量、纤维品质等性状QTL[2,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16]。由于利用种间杂交群体构建的遗传图谱难以用于陆地棉遗传改良，Shappley等、Ulloa等、Zhang等、Shen等和Guo等利用陆地棉品种间杂交群体，构建了陆地棉种内遗传连锁图谱，并对棉花产量、纤维品质等性状QTL进行了研究。因陆地棉品种间分子标记多态性低，利用陆地棉品种间杂交群体构建的连锁图标记数偏少、基因组覆盖率低，所获QTL数量少，QTL与标记间的图距偏大，难以满足陆地棉纤维品质、产量、抗性等分子标记辅助育种的需要。因此需要开发大量新型标记，尤其与基因紧密连锁的分子标记，用于构建覆盖陆地棉全基因的遗传图谱，获得与QTL紧密连锁的分子标记。【前人研究进展】为此，Saha等、Han等、Qureshi等和Guo等相继开发了棉花EST-SSR标记，并用于棉花遗传连锁图谱的构建。Lin等将SRAP标记用于棉花遗传连锁图谱的构建。到目前为止，利用陆地棉品种间杂交群体所构遗传连锁图谱基因组覆盖率仅为23%，Ulloa等利用4个陆地棉品种间杂交群体构建的整合遗传连图谱基因组覆盖率约31%。【本研究切入点】Weining&Langridge认为基因启动子、内含子-外显子拼接位点、前体RNA的3′端加A位点都具有与基因紧密连锁的特点，可用来设计PCR引物。于是Weining&Langridge根据内含子-外显子拼接位点（intron-exonsplicejunction,ISJ）的保守序列，设计扩增内含子或外显子的ISJ标记引物，并利用ISJ单引物对小麦和大麦基因组DNA进行PCR扩增，发现ISJ单引物PCR扩增效果差，而ISJ引物与α-淀粉酶基因保守序列引物组合的PCR扩增效果好。【拟解决的关键问题】本研究根据内含子拼接位点的保守序列，设计扩增内含子的IT-ISJ(intron-targetedintron-exonjunction,IT-ISJ）标记的正、反向引物组合。利用不同IT-ISJ引物组合对陆地棉重组近交系群体进行标记基因型检测，构建遗传连锁图谱，以确定其在作物遗传连锁图谱构建中的应用价值。1材料和方法1.1fps1fps于2006年在西南大学重庆北碚歇马科研基地种植Wan等建立的270个（渝棉1号×T586)F2:7重组近交系，设单行区（5m×0.7m）。重组近交系、渝棉1号、T586和F1幼叶DNA的提取采用CTAB法。1.2反向引物及碱基的选择IT-ISJ标记物参照Weining&Langridge的方法设计，正向引物的核心部分为拼接位点5′端保守序列CAGGTAAGT，引物5′端加上限制性内切酶SphⅠ的识别序列GCATGC，引物3′端加上3个选择碱基；反向引物的核心部分为拼接位点3′端保守序列ACCTGCA，引物5′端加上限制性内切酶EcoRⅠ的识别序列GAATTC，引物3′端加上任意3个选择碱基。IT-ISJ标记引物由上海英骏生物技术有限公司合成。部分引物序列见表1。1.3pcr扩增条件的方法。IT-ISJ标记PCR反应体系为10µl，其中包括：1×PCRbuffer,2.5mmol·L-1MgCl2,0.2mmol·L-1dNTP,0.5µmol·L-1引物，0.5UTaq酶，50ng模板DNA。PCR反应程序为：94℃变性5min；随后进行以下40个循环：94℃变性45s,50℃退火45s,72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。检测方法与SSR相同。1.4引物筛选及标记基因型鉴定田间鉴定（T586×渝棉1号）F2:7重组近交系群体的8个形态标记，鸡脚叶（L20）、棕色纤维（Lc1）、红色植株（R1）和植株密生茸毛（T1）为共显性，花斑有红心（R2）、光籽（N1）、黄色花粉（P1）和黄色花冠（Y1）为显性。利用已定位在染色体的棉花SSR标记引物和IT-ISJ标记引物组合对渝棉1号、T586和F1进行引物多态性筛选，多态性引物对270个重组近交系进行标记基因型检测。重组近交系表现T586带型的记为A，表现渝棉1号的带型记为B，杂合体（F1类型）记为H。标记命名为引物名或引物组合后加一反斜杠紧跟一数字，显性位点数字表示引物在某亲本扩增出片段的大小（碱基对，bp），共显性位点数字表示引物在亲本之间扩增出的较小片段的大小。1.5kosampi法采用作图软件JoinMap3.0进行标记连锁分析，LOD=4.0，重组率0.4，采用Kosambi作图函数，构建遗传连锁图。利用已定位在染色体的形态标记和SSR标记，确定IT-ISJ标记在染色体上的分布。采用绘图软件MapChart2.2绘制连锁图。2结果与分析2.1增出35个清晰的片段不同IT-ISJ引物组合在渝棉1号和多显性基因标记系T586间扩增出3～15个清晰的特异片段（图1），片段大小多为90～700bp，其中49个引物组合在两亲本间具多态性，占筛选引物的7.0%。除特异性片段外，多数IT-ISJ引物组合还扩增出非特异性片段。2.2ssr标记的偏离性和连锁分析49个多态性IT-ISJ引物组合，检测（渝棉1号×T586)F2:7重组近交系群体，获得58个标记位点（图2～4），其中，9个引物组合产生2个位点。58个位点中有56个表现为显性，占96.6%；2个表现为共显性，占3.4%。58个标记位点中有26个位点偏离1﹕1的孟德尔分离比例，占标记位点的44.8%，其中8个位点表现较严重的偏分离（χ2>10），占IT-ISJ标记位点的13.8%。3个偏分形态标记均表现较严重的偏分离，占形态标记的37.5%；46个SSR标记位点表现偏分离，占SSR标记的30.7%，其中10个位点表现较严重的偏分离，占SSR标记的5.3%。利用遗传图谱构建软件JoinMap3.0，对58个IT-ISJ、150个SSR和8个形态标记位点进行遗传连锁分析，构建的遗传连锁图谱包括22个连锁群、113个位点（49个IT-ISJ、62个SSR和2个形态标记）（表2，图5）。连锁图谱覆盖714.5cM，占棉花基因组16.1%，标记间平均距离为6.3cM。49个IT-ISJ标记分布在22个连锁群，其中20连锁群定位到染色体。多数偏分离位点集中在连锁图谱的少数区域，如第9、13、21染色体与Un02连锁群。3pcr扩增程序检测自Bostein发明RFLP标记以来，分子标记已被广泛应用于遗传多样性分析、基因组比较、遗传图谱构建、基因定位、标记辅助育种和基因克隆等方面的研究。应用广泛的RFLP标记，技术复杂，费用高，耗时长，应用不方便。基于PCR的标记类型多样，各有优缺点。如RAPD(randomlyamplifiedpolymorphicDNA）标记，方法简单，成本低，但重复性较差。AFLP检测位点多，多态性好，但分析程序较复杂，而且由于基因组DNA的甲基化，使用甲基化敏感的限制酶会导致“假多态性”的产生。SSR多为共显性，重复性好，但引物开发成本高。利用现有标记构建的遗传图谱，所检测QTL大多与标记距离偏远，不能满足分子标记辅助选择。因此需要设计与基因/QTL紧密连锁的新型标记，而基因启动子、增强子、前体mRNA加A位点、内含子-外显子拼接边界和翻译起始信号等保守区域能满足这一标准。绝大多数植物基因都存在内含子，且内含子与外显子的结合区域高度保守。与外显子相比，通常内含子所受到的选择压力较弱，内含子碱基序列和长度在不同物种甚至不同个体间变异大。本研究利用704个IT-ISJ引物组合对渝棉1号与T586进行多态性筛选，获得49个态性引物组合，占所用引物的7.0%。Wan等利用4551对SSR引物对渝棉1号与T586进行筛选，获得346对多态性SSR引物，多态性引物占7.6%。说明IT-ISJ标记的多态性接近SSR标记。IT-ISJ标记根据内含子拼接位点设计，同时正向引物与反向引物可任意组合，而SSR标记引物的开发需要克隆测序，且正向引物与反向引物不能任意组合，因此IT-ISJ标记的成本远低于SSR标记。为确定扩增片段是否是内含子，下一步需对IT-IST引物组合扩增产物进行克隆测序研究。本研究选用的IT-ISJ引物组合，除扩增出特异性片段外，同时还扩增出一些非特异片段，其原因可能是退火温度偏低引起，但并不影响IT-ISJ标记的结果可靠性，因IT-ISJ标记扩增程序是基于SRAP标记扩增程序改进，去掉了SRAP标记PCR扩增程序前5个循环的35℃退火步骤，理论上稳定性优于SRAP。在渝棉1号和T586间具多态性的49个IT-ISJ引物组合，检测（T586×渝棉1号）F2:7重组近交系群体270个系，获得58个标记位点，其中56个表现为显性，占96.6%，表明IT-ISJ标记主要表现为显性。IT-ISJ标记偏分离位点占44.8%，但较严重偏分离位点（χ2>10）仅占13.8%；形态标记较严重偏分离占37.5%；SSR标记偏分离位点占30.7%，较严重偏分离位点占5.3%。多数偏分离位点集中在连锁图谱的少数区域。一方面说明利用渝棉1号和T586建立的重组近交系群体适宜于遗传图谱构建，另一方面说明IT-ISJ偏分离位点不是其本身的原因。目前用于获得与基因相关的标记有EST-SSR、SRAP以及本研究设计的IT