糖尿病模型的建立与应用

糖尿病模型的建立与应用

糖尿病是一种慢性代谢疾病。世界上约有1.7亿患者，预计到2030年，这一数字将被兑换成两倍。可靠的动物模型是研究糖尿病发生机制及新的干预措施的重要手段。建立动物模型的过程中,动物种属、品系的选择非常重要。用小鼠建立模型、开展生物医学实验较其它动物有显著的优越性:小鼠体积小,生殖周期短,容易通过饲料、药物处理或遗传方法诱导疾病;小鼠的基因序列的详细图谱已经完成,建立了多样、独特的基因库;已有的近交系小鼠达450多种,每个品系的基因具有同质性,表现出独特的表型;小鼠胚胎干细胞的分离培养使人们能够破坏特定预选基因的表达和功能。此外,人们正在组建已知基因发生多种突变而功能改变的小鼠库。这些独特的资源使得采用小鼠研究疾病的发生非常方便。本文就研究糖尿病及其常见并发症(肾病、心血管病)所用的模型小鼠作一综述。1附近杂交系统的老鼠1.1对脏器功能的影响C57BL/6J是应用最广泛的近交系小鼠,易饲养,寿命长,对肿瘤易感性低,对膳食诱导的肥胖、2型糖尿病、动脉粥样硬化高度敏感。C57BL/6J饲以高脂饲料,出现肥胖、高血糖和低胰岛素血症,但对肾脏功能无影响。C57BL/6J为第一个高质量的小鼠基因图谱分析提供了DNA来源。该品系被广泛用于心血管疾病、发育生物学、糖尿病和肥胖等的研究。1.2bsks/jdb/db糖尿病小鼠脏器基因特征见表1C57BLKS品系源于C57BL/6J,对肾脏疾病较C57BL/6J更易感。C57BLKS/J小鼠84%的等位基因与C57BL/6小鼠一致,16%与DBA/2J品系一致。C57BLKS/Jdb/db糖尿病小鼠肾脏的病变符合糖尿病肾病的特点(基底膜增厚、肾小球系膜扩张)。C57BLKS品系对动脉粥样硬化也比较易感。1.3对高脂肪、高胆固醇的饲料与C57BL/6J不同,DBA/2J容易出现糖尿病性蛋白尿,对半合成的高脂饲料诱导的动脉粥样硬化稍有抗性,对含有高脂肪、高胆固醇的饲料反应低下。1.41糖尿病肾病易感模型在脱氧皮质酮(DOCA)-盐高血压模型中,129/SvJ品系对高血压、肾硬化(肾小球和肾小管硬化)、蛋白尿较C57BL/6J易感,是研究糖尿病肾病有潜在吸引力的模型。可惜携带db/db突变的129/SvJ对高血糖有抗性。1.5糖尿病抗性mhc单倍型非肥胖非糖尿病(NON)小鼠与非肥胖糖尿病(NOD)小鼠密切相关,是杂交产生NOD品系时的非糖尿病后代。NON小鼠含有糖尿病抗性MHC单倍型(Kb,I-Anb1,I-Ek,Db),这与NOD小鼠含有的与糖尿病易感性有关的单倍型(Kd,I-Ag7,I-Enull,Db)不同。虽然有些研究采用NON小鼠作为NOD小鼠的对照,但有NON小鼠出现不明原因的自发性糖尿病肾病。因此,其作为糖尿病肾病研究的对照尚存争议。2当基因发生自发突变时2.1blps/j对db/db小鼠血糖的影响db/db小鼠是研究最深入的2型糖尿病肾病模型,1966年在美国被首次发现,该小鼠断乳后出现摄食过多。糖尿病基因(db)编码瘦素(leptin)受体G到T的点突变,呈常染色体隐性遗传。该突变导致贮脂细胞分泌的激素——瘦素的异常拼接、信号传导缺失,瘦素信号至下丘脑的传导缺失导致摄食过量、肥胖、高瘦素血症、高胰岛素血症。这一肥胖、糖尿病突变体起初是在C57BLKS/J品系中发现的,后来回交入纯种的C57BL/6J。C57BL/6J背景的db/db小鼠,摄食过量、体重增加的程度与C57BLKS/J背景的相似,但高血糖水平较低。所有db/db小鼠4周龄后都出现肥胖,10日龄后即可见高胰岛素血症,2月龄后体重增加50%。并非所有动物都会出现高血糖,不同克隆的高血糖发生率不同。Ziyadeh等报道db/db雄性小鼠的肌酐清除率先增高2倍,16周龄肌酐清除率降低30%~50%。多数报道db/db小鼠8周龄时尿蛋白排泄量平均增加40倍,8~25周内蛋白尿水平高而稳定。db/db糖尿病小鼠高血糖发生前,与同窝的非糖尿病小鼠比较,各项肾小球指标都没有差异。5~6月龄后,肾小球增大,肾小球系膜间质增多。6~8月龄肾间质内白细胞增多,出现肾小管扩张、萎缩、凋亡、早期间质纤维化。8月龄肾小球、肾皮质内单核细胞化学引物蛋白、骨桥蛋白、巨噬细胞抑制因子、巨噬细胞克隆刺激因子的基因表达增加。db/db小鼠肾小球系膜间质的构成蛋白发生变化:细胞外基质蛋白,包括Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白增加。这些化学因子的上调与糖尿病的出现和持续时间有关。人类糖尿病肾病也报道过这些改变。20月龄后,肾小球基底膜(GBM)厚度呈线性增加,并出现结节性病变(与人类糖尿病肾病所见的Kimmelsteil-Wlison结节不同)。db/db小鼠肾脏结构改变,尤其是间质扩张,与人类糖尿病肾病最接近。目前,db/db小鼠的背景、糖尿病和肥胖发生的自然历程、肾功能改变以及肾小球、肾间质的病理改变等已经得到了充分研究。2.2肾病理s/l/6与db/db突变体不同,ob/ob隐性肥胖小鼠携带瘦素的突变。有两种类型的ob/ob小鼠:一种是C57BLKS/J背景,出现β细胞萎缩、严重的高血糖;另一种是C57BL/6背景,仅出现胰腺管增生、轻微的高血糖。ob/ob小鼠的肾脏病理主要表现为:肾小球出现弥漫性、结节性脂质透明样(lipohyaline)改变。ob/ob小鼠与db/db小鼠比较,肾脏疾病更少。这可能是由于ob/ob小鼠缺乏循环的瘦素,而瘦素可以直接刺激间质产生。2.3外源性胰岛素质中pa胰岛素-2Akita(insulin-2Akita,Ins2Akita)小鼠,胰岛素2错折叠,选择性地对胰腺β细胞产生蛋白质毒性,导致β细胞功能不全。该小鼠的胰岛缺少β细胞,存活的β细胞分泌极少量的成熟胰岛素,对外源性的胰岛素有反应,可作为四氧嘧啶或STZ诱导的胰岛素依赖的糖尿病小鼠的替代物。Ins2Akita突变为常染色体显性遗传,杂合子存活率和生殖力强,约在3~4周龄出现高血糖、低胰岛素、烦渴多饮。目前C57BL/6、C3H/He存在该突变。C57BL/6背景的Ins2Akita小鼠,蛋白尿不是其主要特征,糖尿病肾病也不严重。2.4nod小鼠的基因特征NOD小鼠是研究最深入的低胰岛素1型糖尿病小鼠。该小鼠约5月龄时β细胞出现自发性自身免疫性破坏,糖尿病开始的确切年龄稍有差异。该小鼠与人类1型糖尿病的特征有许多相似之处:含有特异性主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类等位基因和许多非MHC位点作为多基因易感性位点;通过造血干细胞传播疾病;胰岛内炎性细胞浸润(胰腺炎),有胰岛自身抗体;对T细胞严重依赖。少数有关NOD小鼠肾脏疾病的研究表明,该小鼠仅出现微弱的肾异常。早期肾脏病理研究显示:肾小球基底膜增厚,弥漫性肾小球硬化。2.5糖尿病并发症的病理变化新西兰肥胖小鼠(NZO)表现出多基因遗传的糖尿病、肥胖,而且有高胰岛素血症,肾病理损害更为明显,包括系膜基质弥漫性、结节性扩张,肾小球基底膜增厚和渗出性病变。2.6降血糖药、降糖药和麻黄KK小鼠对胰岛素有轻度抗性,易于出现类似糖尿病肾病的肾脏损害。将豚鼠(ay)等位基因引入KK小鼠,高血糖和胰岛素抗性加重。KK和KK-ay小鼠都出现结节性肾小球硬化和肾小球系膜增生,控制血糖可改善病变。随着年龄增长,蛋白尿进行性升高,但未见肾衰报道。3糖尿病肾病mb事件转基因小鼠模型能够使人们对加重糖尿病肾病的因素有所了解。最近,已采用基因改变(基因敲除、转基因)的小鼠品系研究氧化应激、糖基化终末产物(AGE)、炎症、profibrotic机制在糖尿病肾病发生中的作用。3.1动脉血药及血脂载脂蛋白E(ApoE)在血浆脂蛋白上循环。人类ApoE基因定位于染色体19q13.2,有3个等位基因:2、3、4,编码ApoE异构蛋白E2、E3、E4。ApoE异构体对LDL受体的结合力不同,E4结合力最强,而E2不能与LDL受体结合,对甘油三酯的清除能力低下。破坏小鼠的ApoE基因位点,血浆中ApoE缺乏,残余脂蛋白的清除受阻,血清胆固醇和甘油三酯升高,对动脉粥样硬化的敏感性增高。载脂蛋白E缺陷(ApoE-/-)小鼠是自发性动脉粥样硬化的小鼠模型。ApoE-/-小鼠正常饲料下即出现严重的高胆固醇血症(由于乳糜微粒、VLDL残余脂蛋白蓄积),主动脉根部出现自发性粥样硬化,主动脉分叉处出现广泛的纤维斑块,其分布与人类动脉粥样硬化相似。饲以Western型饲料(0.15%胆固醇和21%的脂肪),则出现极度的高胆固醇血症,动脉粥样硬化病变发生、发展加速。ApoE-/-小鼠对血管损伤更易感,糖尿病并发症的发生较野生型更快速,链脲菌素(STZ)处理的ApoE-/-小鼠出现1型糖尿病的典型特征:高血糖、胰岛素相对缺乏。与未经STZ处理、血糖正常的ApoE-/-小鼠相比,血浆胆固醇、乳糜微粒/VLDL、IDL/LDL、TG、HDL水平、糖基化终产物(AGE)水平均升高;胸主动脉和主动脉弓的主要分叉处出现明显的粥样硬化病变。AGE的可溶性受体可以显著减轻动脉粥样硬化病变,因此加速的动脉粥样硬化与高血糖有关。然而,ApoE-/-模型本身有血脂障碍,血脂障碍不是人类1型糖尿病的特征,有时难以区分加速的动脉粥样硬化是糖尿病的作用还是血脂障碍的作用。ApoE基因敲除C57BL/6J小鼠经STZ诱导后,组织病理检查和蛋白尿测定显示肾脏病变加重。3.2高胆固醇wldlr-/-小鼠饲药状况血浆LDL胆固醇升高是人类冠心病的常见危险因素。1993年,Ishibashi等通过基因打靶技术建立了LDL受体缺陷(LDLR-/-)小鼠。LDLR-/-小鼠饲以正常颗粒饲料时,出现中等程度的高胆固醇血症(胆固醇水平约为250mg/dl,主要由于LDL胆固醇蓄积),不出现明显的动脉粥样硬化病变。LDLR-/-小鼠对饲料诱导的高胆固醇血症非常敏感,饲以Western型饲料时,出现严重的高胆固醇血症(胆固醇水平约为1000~1200mg/dl),严重的动脉粥样硬化病变遍布主动脉树。Reaven等用STZ处理LDLR-/-小鼠,出现高血糖、VLDL胆固醇和AGE抗原升高,但与对照比较,未见明显的动脉粥样硬化改变。3.3enos的表达减少糖尿病患者内皮细胞功能不全与血管内一氧化氮合成受损有关。一氧化氮合酶(eNOS)定位于人类7号染色体上,具有多态性,与血管病变有关。最近报道eNOS多态性导致eNOS表达减少与1型、2型糖尿病患者的晚期肾病有关。虽然尚未在小鼠观察基因敲除eNOS对糖尿病肾病发生的影响,但有研究表明,小鼠eNOS、ApoE基因同时缺失可导致动脉粥样硬化、高血压、肾功能不全加重。3.4抗炎与免疫调节作用AGE是长期高血糖暴露出现的一种非酶性糖基化蛋白。AGE的产生是糖尿病的主要特征。糖尿病患者肾小球出现AGE、尤其是羧甲基赖氨酸修饰的加合物的蓄积。AGE可通过受体依赖机制和受体介导的信号通路影响细胞功能。AGE与AGE受体(RAGE,信号转导受体)结合,介导多种细胞反应。在糖尿病肾病中,可能在小管间质纤维化中起作用。中和高血糖db/db小鼠内水溶性的RAGE可减轻肾小球的损害。3.5glut1表达葡萄糖转运子1(GLUT1)是肾小球葡萄糖转运的主要转运子。高血糖或糖尿病使体外培养的肾小球系膜细胞和整个肾小球内GLUT1表达增加。推测肾脏内敏感细胞浆膜上GLUT1表达增多将导致葡萄糖代谢性内流增加,可能通过增加自由基产生导致葡萄糖毒性。研究表明,血糖正常的GLUT1转基因小鼠出现肾小球系膜扩张和蛋