口腔扁平苔藓病损局部组织中il-17表达的初步探索

口腔扁平苔藓病损局部组织中il-17表达的初步探索

扁平口腔是一种常见的口腔粘膜慢性炎症疾病。根据这项研究，olp主要是由t细胞诱导的自身免疫性损伤。几种细胞因子形成复杂的相互作用网络，共同影响局部的免疫功能。Th17细胞通过产生白细胞介素-17(interleukin,IL-17)等促炎细胞因子,介导炎症反应、调节免疫应答,在自身免疫性疾病和宿主防御反应中发挥重要作用。本课题组应用全基因组寡核苷酸芯片技术分析OLP病损组织的基因表达谱,发现IL-17mRNA显著上调,提示IL-17可能参与了OLP的发生发展过程。因而本课题拟检测IL-17在OLP局部病损组织的表达情况,为了解Th17细胞在OLP发病过程中的作用提供初步的研究依据。材料和方法一、口腔扁平苔藓的插入和排除二、组织与组织间样品收集2006~2007年中山大学附属口腔医院的26例OLP初诊患者的活检组织,部分制成组织匀浆(Pierce,美国),取上清液-80℃贮存备用;部分组织用4%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋切片,并经病理科医生确诊为OLP。6例健康对照组织取自正颌外科手术患者颊黏膜,制备成组织匀浆液,保存条件同上;免疫组化阳性对照片取自舌癌患者术中摘除之颈深上淋巴结,经病理检查未发现有癌细胞转移灶。三、酶标仪检测活性采用HumanIL-17AELISA试剂盒(eBioscience,美国),按照说明书方法检测IL-17,Tecan酶标仪(Tecan,奥地利)检测样本450nm下的吸光度(A)值,绘制标准曲线,得到样品浓度值。采用BCA蛋白质定量检测试剂盒(上海生工,中国)检测组织匀浆总蛋白,Tecan酶标仪上检测562nm下的A值,绘制标准曲线,得到样品浓度值。根据公式IL-17相对含量(pg/mg)=细胞因子含量(pg/ml)/总蛋白含量(mg/ml),计算出IL-17的相对含量。四、枸杞酸盐缓冲液缓冲液制备采用UltraSensitiveTMS-P试剂盒(福州迈新,中国),按照说明书方法进行。微波抗原修复时,0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液预先微波加热至沸腾,放入切片,中低档微波继续加热15~20min,室温下自然冷却,用山羊抗人IL-17一抗(R&DSystems,美国),滴度1∶20,37℃湿盒内孵育1h,DAB显色(武汉博士德,中国)。以淋巴结组织作为阳性对照片,以PBS代替一抗作为空白对照。五、非参数秩和检验数据统计由StatisticalAnalysisSystem8.1(SAS8.1,SASInstituteInc.)处理,蛋白浓度、细胞因子含量等以中位数(四分位数间距)表示,对IL-17相对含量结果进行非参数秩和检验,检验水准双侧α=0.05。结果一、il-17相对含量不服从正态分布计算IL-17相对含量,经散点分布图和方差分析检验,发现OLP组IL-17相对含量不服从正态分布,因而数据用中位数和四分位数间距表示(表1)。对IL-17相对含量结果进行非参数秩和检验,两组间差异无统计学意义(t=99,P>0.05)。二、hsb阳性染色光镜下基底细胞排列紊乱,部分病例可见上皮下疱,上皮钉突呈不规则形状,固有层可见密集淋巴细胞浸润带,符合OLP的病理特征。阳性对照片中淋巴结阳性染色主要分布于胞浆(图1)。IL-17阳性染色主要在固有层散在分布,在表皮不完整的糜烂处及上皮下疱处,阳性细胞明显增多,上皮内极少见阳性染色;高倍镜下IL-17阳性染色主要分布在胞浆,呈棕黄色,部分IL-17阳性细胞的胞外间隙也可见弱阳性染色(图2)。il-17在op治疗中的表达水平分析近年来发现的一类以产生IL-17为特征的效应性CD4+T细胞亚群,称为Th17细胞,在宿主防御和免疫调节发挥着重要作用。作为一种强促炎细胞因子,IL-17能够诱导其他细胞因子和趋化因子表达,从而介导炎症细胞募集、浸润和组织损伤。重要的是,研究发现Th17细胞和IL-17与某些自身免疫性疾病的发生发展密切相关。IL-17或IL-17mRNA水平在类风湿性关节炎、系统性硬化症、哮喘、舍格伦综合征组织或血清中表达显著上调,表明Th17细胞和IL-17在自身免疫疾病的发生和维持中起一定作用。OLP具有许多自身免疫性疾病的特点,如疾病的慢性持续性、成人易患、女性好发、免疫抑制功能降低、病损区存在自身毒性T细胞克隆等。目前OLP的发病机制仍未完全予以阐明,但众多的研究认为,T细胞介导的免疫损伤在OLP的发生发展中起重要的作用。本课题组在前期实验中应用全基因组寡核苷酸芯片技术分析OLP病损组织的基因表达谱,发现IL-17mRNA显著上调,提示IL-17可能参与了OLP的发生发展。在本研究中,检测了OLP病损组织中IL-17的定量表达并观察IL-17阳性细胞的组织分布。结果发现,在所有标本中均能检测出IL-17表达,部分标本高表达,但与正常对照组织相比,其总体相对含量差异无统计学意义(P>0.05);IL-17阳性染色主要在固有层散在分布,在表皮不完整的糜烂处及上皮下疱处,阳性细胞明显增多,上皮内极少见阳性染色。高倍镜下IL-17阳性染色主要分布在胞浆,部分IL-17阳性细胞的胞外间隙也可见弱阳性染色。在多数研究中,IL-17在炎症性疾病和自身免疫性疾病中均有高表达,而本研究结果发现,OLP中IL-17表达的平均水平并不比正常对照组高。但同时发现,IL-17相对含量的表达水平范围明显大于对照组,在部分病例中IL-17相对含量明显升高,甚至高出近20倍。免疫组化结果也证实,在表皮不完整的糜烂处和上皮下疱处,阳性细胞明显增多。OLP是针对基底层细胞的自身免疫性损伤,免疫病理显示在基底膜区可见细小颗粒状荧光,基底膜区的免疫活性处于相对活跃状态,在这些区域IL-17的表达和作用可能会增强。这些结果提示,IL-17可能在不同类型的OLP中表达水平不尽相同,而在某些类型如糜烂型,IL-17的表达可能是增高的。Nistala等在研究青少年特发性关节炎时也得出类似的结果,他们发现滑膜液单核细胞中IL-17表达水平与关节炎临床表型相关,在重型关节炎中的表达水平显著高于轻型关节炎。在本实验当前的样本量(n=26)下,IL-17表达并不比正常对照组高,这就提示需要按OLP的临床表型进行分层,并增加样本量作进一步分析。本研究在使用全基因组寡核苷酸芯片技术分析OLP病损组织的基因表达谱时发现,IL-17mRNA表达水平上调7.31倍,但在蛋白水平上未发现显著差异,是否存在转录后调控,亦或IL-17水平