微卫星与单核苷酸多态性在动物遗传检测中的应用

微卫星与单核苷酸多态性在动物遗传检测中的应用

在药物和药理学实验中，中心交系和远交系（封闭组）小鼠作为重要的动物模型发挥着重要作用。实验动物的遗传稳定性,会随着偶然的错配或遗传漂变使其发生遗传背景的改变,从而影响实验的准确性与可靠性。定期对实验用大小鼠进行遗传学检测是保证其遗传质量必不可少的措施。传统遗传检测方法有形态学、免疫学和生物化学等方法,但这些方法有其局限性,且不能有效地检测出各个亚系之间的遗传差异。随着一系列分子遗传标记的发现,分子生物学检测方法被应用于实验动物遗传检测,可直接检验动物核酸序列的改变,为近交系动物的遗传检测提供了直接客观的途径。当前,检测DNA多态性方法主要有DNA指纹技术、随机扩增多态性(RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)、PCR单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)[9—11]和微卫星(Microsatellite)[12—22]等。其中微卫星和SNP已经大量应用于实验动物的遗传检测。微卫星DNA是由2—6bp碱基组成的一个多次串联重复序列,又称为短序列重复(Shorttandemrepeat,STR)、简单重复序列(Singlesequencerepeats,SSR),普遍存在于真核生物的基因组中,平均每10kb就出现一个STR。通过其可以对多态信息含量(PIC)、群体杂合度分析、遗传距离分析等进行准确的测定,已广泛应用于群体遗传学分析、基因图谱分析及亲缘关系等研究。SNP是继RAPD和微卫星标记之后的第三代遗传标记。SNP是指在基因组DNA中某个特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变异所引起的DNA序列多态性。通常认为SNP是有两种类型,即双等位基因。SNP是基因组中最丰富的DNA序列变化形式,是最常见的可遗传变异。1星和sph的特点1.1微卫星监测技术的遗传稳定性微卫星广泛分布于真核生物基因组中,微卫星DNA序列具有以下特点:1)保守性:微卫星位点在种内是高度保守的,在近似种间也有一定的保守性,即在一些紧密相关的物种中其重复单位和重复次数具有一定相似性;2)微卫星标记的等位基因符合孟德尔遗传定律;3)多态性:在正常动物群体中微卫星拷贝数在某一群体中是可变的;4)具有遗传连锁不平衡现象;5)有些位于编码区可被转录,而另一些分布于非编码区而在不同基因位点上的微卫星DNA的重复序列可以不同,也可相同。1.2symp的特点2星和sph遗传检测方法2.1检测手段多样化科学合理的利用微卫星标记的遗传学特点,对其进行准确的鉴定和检测是其应用研究的基础。伴随着分子生物学技术的迅速发展,对微卫星DNA的检测手段也更加多样化,进而使其检测的成本降低、灵敏度升高、检测程序的标准化程度提高。目前有以下几种主要的检测方法。2.2实时荧光定量pcr技术自从SNP被提出之后,研究者对筛查SNP的方法进行了不断的探索和改进,已建立的SNP分析方法很多,包括限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP),直接测序,高效液相色谱(DHPLC),等位基因特异性PCR(AS-PCR)、基质辅助激光解析飞行时间质谱分析(MALDI-TOFMS)、单链构象多态性(Singlestrandconformationpolymorphism,PCR-SSCP)、基于高温连接酶的连接检测反应(ligasedetectionreaction,LDR)和实时荧光定量PCR等技术。对其中最为主要的几种方法简要概述。2.2.1ss-pcr检测dna分子中的化合物基于PCR技术的以构象为基础的检测基因组中SNP的方法,用内切酶降解DNA样品后做变性处理,非变性条件下,电泳,单链DNA链内碱基互作发生卷曲而形成一个较为稳定的空间构象,DNA序列的改变会使卷曲的DNA分子构象发生改变,所以,有序列差异的DNA分子通过非变性凝胶时,由于构象的不同,所受到的阻力大小也就不同,结果是涌动的速度不同,此方法结合了毛细管电泳,可以显著的提高通量,最后经条件优化,提高了分辨率。2.2.2as-pcr2.2.3碱基检测snps法测定碱基因子可精确检测产物到达监视器的飞行时间与其质量相关关系,可与许多其他方法结合检测SNPs,如同小序列结合精确鉴别4种碱基间质量差异,为SNP检测提供了新工具。2.2.4pcr-ldr该平台的建立基于近交系小鼠SNP快速分型方法,用于检测实验小鼠的遗传质量与品系纯度。2.2.5基于snp的snp测定法通过对PCR扩增反应中每一个循环的产物的荧光信号进行追踪,达到对初始模板进行定量分析的目的,基于该法扩增反应的SNP测定法具有特异性高、成本低、快速简便的特点,适合进行大规模DNA样品的SNP检测工作。3大鼠微卫星和sph遗传检测3.1小鼠遗传检测微卫星具有基因位点多、多态性高、扩增片段短等突出特点,在实验小鼠品系的鉴定中实验价值较高。近交系和封闭群小鼠中微卫星长度变化有很低的发生率,因此,微卫星的长度可以作为某一品系小鼠恒定的参数,而在不同近交系小鼠之间微卫星的长度有所差异,所以近交系小鼠的遗传检测可通过微卫星位点进行鉴定。Teppner等用153个微卫星位点对C57BL/6、CFW和ICR的遗传背景小鼠进行分析,发现ICR和CFW与C57BL/6不同分别有76和70个位点;王洪等用20对引物对12个品系(BALB/C、C57BL/6、DBA、C57BL/9、C57BL/10、TAI、TA2、T739、M615、SCID、NIH和KM)的小鼠进行STR扩增,实验结果表明:STR技术,可用于对这些品系小鼠的遗传检测。谢建云等利用22个微卫星位点对2个饲养单位的近交系BALB/C小鼠和封闭群ICR小鼠的遗传特征进行了分析,发现STR不仅可以检测近交系的遗传质量,还可以分析封闭群的遗传多态性。近几年来国内外学者对微卫星标记方法在近交系小鼠遗传分析中的应用进行了广泛的研究,并筛选出一些有鉴别意义的微卫星位点。研究表明,微卫星位点在不同品系以及亚系的小鼠之间具有多态性,可采用微卫星标记方法区分不同的近交小鼠品系及其亚系。到目前为止在小鼠的基因组内共发现7300多个STR位点,其中90%以上具有丰富多态性,以此检测近交系实验动物遗传学质量的报道很多,并且证明该方法的可靠性优于国家标准中的生化标记法,被视为最佳的分子检测手段[20、22]。3.2基于微卫星和ssr的遗传检测大鼠作为重要的实验动物,在生理学、药理学和与人相关的复杂疾病的研究中发挥重要作用。李瑞生等选取大鼠7条染色体上的微卫星位点合成了10对引物,利用PCR技术对6个品系(SHR、SHRSP、LEW、RCS、WKY和F344)的8个近交系大鼠群体进行了DNA微卫星位点多态性的分析,同样发现,大鼠的微卫星位点具有显著多态性:不同品系个体之间以及不同地区同一品系的不同个体之间均存在一定的差异。该方法为近交系大鼠的遗传背景检测提供了可靠的信息。Elizabeth建立起大鼠微卫星遗传图谱,选取了87个微卫星标记,覆盖20对常染色体,对6种近交系大鼠进行遗传检测,确认40个遗传信息丰富的微卫星位点。Mashimo等对122个大鼠品系的基因组进行简单序列长度多态性(SSLP)标记,报告357个SSLP标记,在20号染色体上有10个SSLP位点。随着分子生物学技术的发展,大鼠的基因组草图已公布,完整的大鼠主要组织相容性复合体(RT1)核苷酸序列将为大鼠主要组织相容性复合体(MHC)的结构和序列分析、多态性研究及单倍体图谱的绘制提供了大量的物质资料。主要组织相容性复合体(RT1)是决定近交系大鼠免疫遗传品质最主要的基因群,也是进行遗传学检测的一个重要研究领域,Takagi等在大鼠主要组织相容性复合体(RT1)区新发现57个SSLP,与已存在的10个SSLPs共67个SSLPs,对67个不同近交系大鼠通过PCR技术进行了基因分型和遗传图谱的绘制。对RT1复合体的基因序列的完善及其相关功能的深入研究,将有利于使大鼠成为成熟实验动物模型。3.3snp位点分析近年来,SNP技术被用于近交系小鼠遗传质量检测,并建立了近交系小鼠的SNP数据库。美国JAX实验室的Petkov等对小鼠的235个SNP位点进行筛选,获取28个信息丰富的SNP位点,这些标记覆盖了所有小鼠常染色体和X染色体,足以鉴别48个近交系小鼠。表明该方法是一个快速、可靠及高效的遗传检测方法。国内,胡培丽等[10、11]采用等位基因专一性扩增,16个SNP位点对5种近交系小鼠进行遗传检测,从基因组水平的单个核苷酸差异来鉴别近交系小鼠遗传质量,发现本方法能够快速、准确地检测出小鼠基因组中的SNP,通过多个SNP位点综合分析,可以有效地鉴别已有的近交系小鼠。SNP标记的发展极大提高了鉴别近交系小鼠遗传背景的能力。3.4snps标记构建及应用Guichoux等通过全基因组鸟枪法片段(Wholegenomicshotgun,WGS)和表达序列标签(Exprssedsequencetags,ESTs)对已识别的高密度33305个候选SNPs进行证实,结果表明,66%的SNPs是在不同大鼠品系中通用的,并新发现287个新的SNPs。Saar等运用3×106个不同SNPs对167种近交系、2种重组近交系和F2互交系大鼠进行基因型分析,共产生20238个有效的SNPs,同时构建了SNPs标记遗传图谱,阐述了连锁不平衡的程度。刘军须等应用近交系大鼠生化标记和分子生物学标记对MIJ和HFJ大鼠进行研究,显示11个生化位点完全纯合,且两个品系大鼠生化遗传概貌完全一致,再对两个品系的大鼠进行了SNP分析研究,确定了MIJ和HFJ大鼠在9个位点的基因型。将由单个核苷酸之间的差异而引起的遗传多样性DNA片段,用于检测基因组单个核苷酸的改变,为进一步完善品系等位基因信息,开发和利用新型动物品系提供了实验依据。SNP是基因组中最丰富的DNA序列的变化形式,是最常见的可遗传变异。许多由于选择压力或者遗传漂变而发生的潜在变异只有通过SNP分析能被检测出来。SNP标记将在大鼠遗传控制检测中成为理想的遗传标记。3.5采用snp库检测小鼠遗传质量2002年,国际小鼠基因组测序联盟完成了经典的实验室品系C57BL/6J(B6)的全测序。同年,Celera公司也完成了另外三个近交系的全序列草图。由于SNP与微卫星数量庞大,高通量的基因分型能降低成本,故著名的实验动物公司都已使用该遗传标记进行遗传检测[52—54]。对于遗传质量检测并没有统一的标准,其位点组合和数量是根据需要和各公司的实际情况决定的。国际上比较知名的实验动物供应商,如TheJacksonLaboratory(JAX),CharlesRiver,Taconic和Harlan等,均提出了各自的遗传监测标准。如TheJacksonLaboratory提供2000个SNP评估芯片(/genome/snp.html),采用27个位点的SNP库对小鼠进行遗传检测然而近交系动物并不是100%等位基因一致,再加上啮齿类拥有上万种微卫星位点和上百万个SNP位点,现在遗传检测的数量和覆盖率是很低的,并不能有效的检测到遗传漂变。但这两类检测方法对于因错配引起的遗传污染非常有效,甚至可以分析出引起污染的小鼠品系。因此,这些知名的实验动物供应商均采用了类似的综合方法进行遗传质量控制,具体内容简述如下。首先,利用毛色等表型特性,避免将毛色一致的品系饲养在同一个房间内;将逃逸的动物安乐死等。在品系管理方面,分为核心群,扩大群和生产群进行分类管理。核心群要求饲养在隔离器中,严格按照全同胞交配(full-sibmating),有明确的谱系(pedigreed)记录。扩大群仍按照全同胞交配,不要求谱系记录。生产群采用随机交配,一般3—5年后,重新从扩大群或核心群引种。对于遗传漂变的控制,主要通过延缓世代间隔的方法。如JAX采用冻存核心群胚胎的方式,一次冻存的胚胎可供10—25年使用,每5代后复苏胚胎回复为原来的核心群,这样相当于10—25年可使用1个世代间隔的小鼠。采用这种方式,100年该品系仅历经4—10个世代间隔,而常规的扩繁方法要历经约300个世代间隔(/jaxnotes/archive/498.pdf)。可见,对于遗传质量检测并没有统一的标准,其位点组合和数量是根据检测具体的需要和各公司的实际情况决定的。4snp检测技术的优势传统的遗传质量检测方法(皮肤移植法、生化标记基因检测、毛色基因检测等)主要通过遗传基因表型特征的变化来推测相应的基因变化,但存在精确度不高,检测位点及反映遗传概貌有限等局限,不能准确地检测出各个品系之间遗传的差异。微卫星作为第二代遗传检测技术,具有高度的多态性和丰富的可供个体识别的标志位点,能够反映出动物的遗传变异情况且操作简单,只需剪小段尾巴提取DNA进行检测,而不必处死大、小鼠,且实验不依赖于昂贵的仪器,因此应用广泛。然而,目前我国微卫星在大、小鼠中的研究,仅局限于不同的实验室各自选用不同的微卫星位点对近交系大、小鼠多态性进行的分析,由于所选的微卫星位点不尽相同,缺乏系统的标准。SNP作为第三代遗传检测技术,具有以下显著的优点:1)相对于生化法和免疫学方法能够鉴别那些本身很难鉴别的一些同基因型和同源品系;2)SNP检测方法比生化法方便的重要优点是不需处死动物,所有基因纯度在其生产下一代之前就得到了保证;3)SNP检测法可达到高通量、低成本及自动化,能够满足大规模的检测需求。由于SNP数据库数目巨大,分析依赖的设备和引物探针成本高,国外主要用于常见的小鼠品系遗传检测,大鼠品系的应用还处于研发阶段。国内小鼠的SNP遗传检测技术还没有普及应用。总之,微卫星和SNP遗传检测技术目前已成为国际上大、小鼠遗传检测的主流技术,二者均有其优势和不足,可以满足不同的检测需要。在国外,大的实验动物供应商已经建立了各自的遗传检测体系,这些位点库(如几个到几百个位点的微卫星库;几十个到几千个位点的SNP库)或者用于常规的遗传检测,或者用于分析某一特定小鼠的遗传特征,这些信息均在其网站公布。在国内,微卫星和SNP遗传检测技术的研究起步较晚,但进展迅速。相信微卫星和SNP遗传检测技术会很快赶超国际先进水平。1.2.1SNP数量多、分布广、密度高:目前为止SNP是分布最广、数量最多的一种遗传多态性。在人类基因组中平均每100—300bp碱基中就有一个SNP,微卫星则在每2—30kb中有一个,有人认为SNP在整个基因组的分布达3×106个。1.2.2富有代表性:某些SNPs能直接影响蛋白质结构或者表达水平