几种重要的dna分子标记技术

几种重要的dna分子标记技术

遗传作为一种易于识别的基因表达，在动物育种研究和育种中发挥着非常重要的作用。目前,应用较为广泛的遗传标记有形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记。形态标记指动物的外部特征,细胞标记主要是染色体的核型和带型,生化标记主要包括同工酶和贮藏蛋白。这3种标记都是基因表达的结果,是对基因的间接反映,标记数目有限,多态性较差,易受环境条件的影响。而DNA分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异,是在DNA水平上遗传变异的直接反映。DNA分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测,数量极多,遍及整个基因组,多态性高,遗传稳定,不受环境及基因表达与否的限制。DNA分子标记从它诞生之日起,就引起了生物学家极大的兴趣,现已广泛应用于基因标记、遗传连锁分析、构建遗传图谱、遗传疾病的诊断、法医学鉴定、亲缘关系和物种的鉴定以及动植物的遗传育种研究中[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13]。在经历了短短几十年的迅猛发展后,分子标记技术日趋成熟。现已出现的DNA分子标记技术有几十种,基本都是建立在RFLP、PCR和重复顺序的基础上的。下面就几种重要的DNA分子标记技术以及微卫星DNA标记技术在实验动物遗传研究中的应用加以介绍。1d基因检测技术1.1rflp标记的基本原理限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP)标记是20世纪80年代初发展起来的第一代分子标记技术(Botstein,etal.,1980)。它利用限制性内切酶可以识别并催化裂解基因组内某些特异DNA序列的原理,来检测基因组内特定DNA片段的差异,这种差异反映了生物基因水平上的变异。RFLP标记的数目多呈孟德尔式遗传,非等位基因的RFLP之间互不干扰,大多数RFLP标记在任何分离群体中都能区分纯合基因型与杂合基因型。RFLP技术是一种能够有效检测DNA多态性的分子生物技术,RFLP检测的是基因组DNA经限制性内切酶酶切后形成DNA片段的多态性。因此在研究群体遗传与系统演化等领域中应用较多。RFLP是第一代分子标记技术,在遗传分析中得到了广泛应用,与传统的遗传标记相比,RFLP标记具有下列优点:(1)RFLP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响;(2)RFLP标记等位基因间是共显性的,非等位基因间不存在上位效应,互不干扰;(3)RFLP起源于基因组DNA的自然变异,这些变异在数量上几乎不受限制,可以选取足够数量能代表整个基因组的RFLP标记。RFLP标记也有其自身的不足,RFLP与内切酶的选用密切相关,只能选用一定的内切酶,某个位点才可能表现出多态性;而且它不能检测出酶切后相同长度DNA片段内的碱基变异.另外,多态性检出率低,用放射性标记的探针进行分子杂交,不但程序复杂繁琐,而且放射性对人体有害。1.2rapd标记RAPD技术是1990年发明发展起来的。它以PCR技术为背景,以人工合成的碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链为引物,对所研究的基因组DNA进行聚合酶链式反应(po1ymerasechainreaction,PCR)扩增,产生多态性的RAPD片段,这些扩增片段的多态性反映了基因组相应区域的多态性[8,9,10,11,12,13,14,15]。RAPD检测分为个体DNA和池DNA两种方法,个体间RAPD分析能够反映出个体间和群体内的遗传变异程度,而池DNA法则重点突出群体间遗传差异。RAPD标记与其它分子标记相比,其优点主要表现在:第一,RAPD技术可以在对物种缺乏分子生物学研究资料的情况下,对其进行DNA多态性分析;第二,RAPD引物可用于不同生物基因组多态性的研究.因此,RAPD引物可以在规模生产形成商品,这大大降低了研究费用.第三,RAPD技术以一系列随机引物对基因组进行检测,因而能检测多个基因位点,覆盖率比较大,并且引物越多,覆盖面越广,遗传信息也随之增加,因此RAPD多态信息含量(PIG)值波动较大,在0.2—0.9之间;第四,RAPD技术操作快速、简便,不依赖基因组遗传信息,因此在遗传研究中被广泛使用。RAPD标记也有不足的一面。首先是显性遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂;其次,由于随机引物较短,因而对一些PCR因素更敏感,重复性较差。一般来说,对于特定的仪器设备,对其反应条件反复进行优化,可以得到较可靠的结果。1.3微卫星dna标记的特点STR标记(shorttandemrepeat)又称简单重复序列(simplesequencerepeat,SSR),是指以少数几个核苷酸(1~6个,多数为2~4个)为单位多次串联重复的DNA序列。这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中,且呈随机均匀分布。它的本体的拷贝数在物种间,甚至种内不同个体间存在高度变异而具有长度多态性。微卫星DNA作为一种遗传标记,与其他分子标记相比,具有如下优点:(1)微卫星DNA数量多且均匀分布在大多数真核生物的基因组中。据估计,真核生物平均每50—150kb就存在一个微卫星位点。它的这一特点为整个基因组中定位更多的基因提供了极大的方便,这是其他方法所远远不及的。(2)微卫星DNA具有丰富的多态性。微卫星DNA标记由核心序列和两侧保守的侧冀序列构成。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域,核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。这种多态性的信息量(PIG)是比较丰富的,一般在0.7以上。(3)微卫星DNA标记易于检测。一般来说,微卫星DNA的长度为200bp左右,这就很容易进行PCR扩增,PCR扩增的高度灵敏性、高度特异性及操作简便省时使微卫星标记的检测十分方便,而且准确。(4)微卫星DNA标记具有保守性。微卫星DNA标记在哺乳动物物种间,特别是一些紧密相关的物种如牛与羊、马属动物以及鸡与火鸡间具有一定程度的保守性。(5)微卫星DNA标记呈共显性遗传。微卫星DNA标记的等位基因遵循孟德尔遗传规律,能够稳定地从上一代传给下一代,并且等位基因间呈共显性遗传。因此从子代可追寻亲代的等位基因,并易于区分纯合型与杂合型。当然微卫星DNA生物技术也有其缺点,即微卫星标记的获得要建立、筛选基因组文件和克隆、测序,实验工作量比较大、费时。但是,由于侧翼序列的保守性,可选用近缘物种的微卫星标记,另一方面,可通过Genbank在有关基因序列中寻找微卫星标记[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10]。1.4dna指纹图谱的特点DNA指纹技术(DNAfingerprinting)是利用微卫星DNA作探针,探测不同生物的卫星区,产生相应的DNA指纹图谱的杂交方法。在80年代,人类遗传学家发现,在人体基因组中含有许多分散的具有串联重复单位的小卫星(minisatellite),一般含11~60个碱基对,由于重复单位的数字不同和重复拷贝数的等位性不同,使其表现出高度多态性。Jefferys等(1991)发现,同一家族的小卫星位点的基本序列单位,都含有一个11~16个碱基对的相同核心序列(coresequence),由核心序列串联重复构成的人源小卫星探针,可以同时与众多的基因组的酶切DNA片段杂交,得到具有个体特异性的DNA图谱。不同生物、同一生物的不同品种,甚至同一品种的不同个体,其所含小卫星各异,杂交产生的DNA图谱各不相同,就象人的指纹一样,所以,把这种具有个体特征和种属特性的DNA图谱称之为DNA指纹图谱。DNA指纹图具有高度的特异性,不同个体或群体有不同的DNA指纹图。DNA指纹技术的一般过程是:将DNA用限制性内切酶消化,电泳分离,再转移至膜,用小卫星、微卫星或合成的寡核昔酸探针以及其他探针予以探测,形成个体特异性杂交图谱DNA指纹具有以下特点:(1)简单的遗传方式。DNA指纹图中的图带可以遗传,这不同于人的指纹。DNA指纹图带遵循简单的孟德尔遗传方式。后代图中的每一条带都可以在双亲之一的图中找到,除非是因为基因突变而产生个别新带。(2)体细胞稳定性。从大量的研究中发现,DNA指纹图带能够稳定的从上一代传给下一代,子代DNA指纹图中的每一条图带均能在双亲的图带中找到,完全符合孟德尔遗传规律。DNA指纹图还具有体细胞稳定性,即从同一个体中不同组织如血液、精液、毛发、肌肉等产生的DNA指纹图完全一致。DNA指纹是分子水平上进行的检测,其分析结果不受环境和发育阶段的影响,同一个体的不同组织(无病变)、不同年龄阶段产生的DNA指纹图完全相同。(3)多位点性。由于基因组中存在着上千个小卫星位点,某些位点的重复单位含有相同或相似的核心序列,在一定的杂交条件下,一个小卫星探针可以同时与多个小卫星位点上的等位基因杂交,产生10~20多条带,每条可分辨的带代表一个位点。而一个常规探针所产生的图谱一般由1~2条带组成,仅代表一个位点。可见,DNA指纹图能够更全面的反映基因组的变异性。(4)高度变异性。DNA指纹图的变异性主要取决于两个因素,一是可分辨的图带数;二是各条图带在群体中出现的频率。倪锦堂(1992)对150个无关个体的DNA指纹图分析表明两个个体图谱具有相同的概率为3、7×10-14,可见DNA指纹图具有高度的个体特异性。(5)一定的物种特异性和个体识别性。同一探针在不同的种(品种)动物上产生的DNA指纹图,在带数、带的深浅和分布上具有不同特点。用不同的探针获得同一个体的DNA指纹图有很大差异,其信息量可以累加。1.5aflp技术特点扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)是在PCR和RFLP的基础上发展起来的新一代分子标记技术。包括三个步骤:(1)DNA被限制性内切酶切割,然后与AFLP接头(adapter)连接;(2)利用PCR方法,通过变性、退火、延伸循环,选择性扩增成套的限制性片段,经过多次循环,可使目的序列扩增到0.5~1μg;(3)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的DNA片段。AFLP兼有RFLP和RAPD两者的优点,被认为是迄今为止最有效的分子标记。它既克服了RFLP技术复杂,RAPD稳定性差、标记呈等显性遗传的缺点,同时又兼有二者之长,具有分辨率高、稳定性好、高效率和高灵敏度等优点。其优点主要表现在(1)AFLP具有RAPD检测DNA的多态性非常高效的优点,可在短期内获得大量的多态性DNA片段,在典型的AFLP反应中,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳一次可检测100~150个扩增产物;(2)AFLP具有RFLP检测可靠的优点,限制性内切酶识别序列专一性决定了检测的可靠性。在AFLP和RFLP技术中,由于采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数目有很多,在理论上,AFLP标记数目是无限的;(3)AFLP可分析不同复杂程度的基因组DNA,且不需预知基因序列特征,检出的多态位点可以覆盖整个基因组DNA,又可以分析克隆DNA大片段;(4)AFLP技术不需要制备探针进行分子杂交,操作简单,易于标准化和自动化;(5)AFLP标记呈典型的孟德尔方式遗传,可作为物理图谱和遗传图谱的联系桥梁,用于构建基因组的高密度连锁图谱;(6)AFLP对模板浓度不敏感,允许一定程度的共扩增;(7)RFLP可以进行定量分析,也可作为等显性标记。2微卫星标记在实验动物育种中的应用2.1基于微卫星dna多态性标记的小鼠遗传检测在传统的遗传监测方法中,形态学标记是利用外部形态,即利用表现型来进行检测,但表现型易受外界环境因素的影响;细胞学标记大多数情况下都要求对细胞进行培育,并进一步制备染色体,而且此类标记数目相对较少。免疫学标记仅能测定一个近交系是否具备同源性,无法确定基因的纯合性;生化标记信息含量低,根据某些生物化学标记,诸如同工酶所进行的遗传检测分析,只能检测编码区的基因座位,且该方法受现在酶电泳和染色方法所限。微卫星DNA多态性标记是选择该位点两侧的侧翼序列为引物,进行锚定PCR扩增,重复性高,可比性强。在DNA水平上,利用DNA多态性测定品种或品系间差异,要比其他标记更稳定,不易受外界因素干扰,能准确、客观地反映遗传差异。因此,微卫星DNA多态性标记在遗传监测方面是较理想的方法。多态性标记,在实践中一方面监测是否发生遗传污染,另一方面可以同时确定样本的品系。目前在利用微卫星DNA多态性标记进行遗传监测方面的研究常见报道。欧阳兆和等选用我国常用的10个品系的近交系小鼠BALBc、C57BL6J、AMMSP1、C3HHe、DBAP2N、129PSv、FVBPN、615、TA1、TA2。筛选的16对微卫星引物(位点名称为:D1Mit365、D2Mit30、D3Mit51、D4Mit235、D5Mit48、D6Mit102、D7Mit281、D8Mit113、D9Mit23、D10Mit180、D11Mit128、D12Mit147、D13Mit88、D14Mit102、D15Mit5、D17Mit36)进行了DNA多态性分析,并与目前常规应用的生化标记分析法进行了比较。除了D8Mit113、D13Mit88外,其余14对引物均具有稳定扩增效果,同一品系内电泳带型一致,表明所检测的小鼠在研究位点上表现为纯合,遗传背景均一,没有发生遗传污染或遗传变异,这与生化位点检测结果一致。14个位点在不同品系之间具有显著多态性(等位基因数目为2~5个),并能特异地反映出10个近交系小鼠的品系特性,可作为近交系小鼠遗传监测的微卫星位点,用于常规检测小鼠品系遗传质量和背景分析等。陈振文等为了解和掌握国内BALBc小鼠遗传质量状况,验证微卫星标记技术在近交系小鼠遗传检测中应用的可靠性,应用所筛选的小鼠不同染色体上的14个微卫星基因座,通过PCR扩增对全国7个地区11个BALBc小鼠群体进行遗传质量分析。结果7个BALBc小鼠群体在14个基因座均呈现一条清晰条带,且群体间呈单态性。4个群体有8个基因座在群体内表现杂合或呈多态性,从而了解了我国BALBc小鼠的遗传状况。牛荣等采用10对微卫星引物对BALBC2nu2nu、DBA2、SCID、T739、TA2、615六种近交系小鼠进行遗传监测,试图寻找相关品系遗传监测的基因位点和应用于实际监测。除1个位点表现为单态性外,其余9个微卫星位点均表现出多态性。其中D2Mit3、D3Mit15、D3Mit17、D3Mit18等4个位点多态性显著,这4个位点适宜用于小鼠遗传监测。说明微卫星DNA多态性标记适用于近交系小鼠遗传监测,有助于遗传监测从表现型过渡到DNA水平。随着不同实验动物染色体高密度微卫星标记图谱的构建,以及实验技术的改进,统计方法的完善,微卫星标记将会在实验动物学研究领域获得更广泛的应用。2.2近交系大鼠群体的dna分析结果实验动物遗传多样性一般指品种内个体在DNA水平上的差异。利用微卫星标记,检测个体基因型,统计群体中的微卫星位点等位基因的数目和频率,结合分子遗传学和数量分类学原理,计算各个品种的遗传变异程度、生存稳定性,初步评估品种的遗传多样性及品种间的亲缘关系与分化关系。李瑞生等采用微卫星DNA技术,对SHR、SHRSP、WKY、F344、RCS、LEW等6个近交系大鼠群体进行DNA多态性分析,结果不同品系个体之间具有显著多态性,同一群体不同个体之间均未差异;对10个位点的相似系数进行统计,结果SHR与SHRSP、SHR和F344间相似系数较高为0.7~0.8,而WKY与LEW、F344间及LEW与RCS间的相似系数较低为0.1。李亮等对四川地方乌骨鸡5个群体的遗传多样性进行了检测,发现四川5个乌骨鸡群体遗传多样性比较丰富,群体平均杂合度为0.538到0.665,5个群体间的遗传距离有一定的差异。Ritz