仔猪腹泻模型的动物模拟实验研究

仔猪腹泻模型的动物模拟实验研究

生猪腹泻是生猪生产中的一种常见疾病，给养猪业带来了巨大的经济损失。大肠杆菌F4和F18是新生仔猪和断奶后仔猪腹泻以及水肿病的主要病原菌。大肠杆菌F4按照菌毛类型可以划分为F4ab、F4ac和F4ad3个亚型,可导致仔猪断奶前腹泻,大肠杆菌F18菌毛分为F18ab和F18ac2个亚型,可导致断奶仔猪腹泻和水肿病。致病性大肠杆菌要发挥其致病作用,首先通过其菌毛粘附于仔猪小肠黏膜上皮细胞刷状缘上,以抵御肠道蠕动和肠液冲洗作用,进而定居,并大量繁殖,分泌肠毒素,刺激小肠分泌大量水分和电解质从而导致仔猪腹泻和水肿病的发生。小鼠作为哺乳类模式动物的代表,具有体积小、饲养管理方便、生产繁殖快、研究深入、有明确的质量控制标准、拥有大量的近交系、突变系和封闭群等优点。如果对小鼠进行细菌攻毒实验能观察到腹泻现象,并能在体外观察到小鼠的小肠上皮细胞与大肠杆菌粘附,那么就可以成功建立仔猪腹泻的小鼠模型,用小鼠模型模拟仔猪腹泻,这将为仔猪腹泻的致病机理研究和通过转基因技术对仔猪腹泻抗性基因进行功能验证奠定基础。本研究利用近交系和远交系小鼠为实验动物,通过对小鼠进行细菌攻毒实验和小鼠小肠上皮细胞与大肠杆菌的粘附实验,研究利用实验小鼠建立仔猪腹泻模型的可行性。1材料和方法1.1日龄研究远交系小鼠为4~5周龄的雄性昆明白;近交系小鼠为4~5周龄的雄性C57BL/6j小鼠日龄参照赵荣山等,均购自军事医学科学院;35日龄大约克断奶仔猪(仔猪日龄参照罗艳茹等)购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所种猪场。1.2猪源、fac、c3493、k9F4菌株:195(F4ab、C83901、O8;K87、猪源),200(F4ac、C83907、O149:K91,猪源)和216(F4ad、C83923、O8:K87,猪源),购自中国兽医药品监察所;F18菌株:F107(F18ab)和8813(F18ac),由扬州大学赠送。1.3菌株培养及培养条件用无菌移液器吸取200μL的无菌水注入安殕管中,将细菌冻干粉制成混悬液,然后将混悬液接种到已灭菌的液体培养基(F4菌株采用LB培养基,F18菌株采用TSB培养基)中37℃振荡培养12h以上,为保证菌毛的表达需在液体培养基中连续培养3代。将在液体培养基里培养好的细菌于4℃4000r/min离心15min,弃上清,加入一定量的生理盐水或PBS,混合均匀,并利用平皿稀释法对细菌悬液中的细菌计数,从而获得已知细菌数的细菌悬液用于以下的攻毒实验和粘附实验。1.4小鼠的细菌注射量选择实验在大肠杆菌F4和F18的众多菌株中,F4ab和F18ab的毒力较强,故本实验选用这2个菌株在昆明白远交系和C57BL/6j近交系小鼠中分别进行腹腔注射攻毒实验,以验证小鼠对猪源大肠杆菌的易感性。具体试验设计如下:昆明白小鼠:挑选体重在16~20g的4周龄小鼠110只,随机均匀分成11组(1~11),其中第1~5组分别注射F4ab细菌,每10g小鼠的细菌注射剂量分别为0.20、0.22、0.24、0.26、0.28mL;第6~10组分别注射F18ab细菌,每10g小鼠的细菌注射剂量分别为0.22、0.24、0.26、0.28、0.30mL;第11组为对照组,每10g小鼠注射0.30mL的生理盐水。C57BL/6j小鼠:挑选体重在8~12g的4周龄小鼠70只,随机均匀分成7组(1~7),考虑到一般情况下近交系小鼠的抵抗力比远交系小鼠差,所以对近交系小鼠的注射剂量稍做降低,其中第1~3组分别注射F4ab细菌,每10g小鼠的细菌注射剂量分别为0.14、0.16、0.18mL;第4~6组分别注射F18ab细菌,每10g小鼠的细菌注射剂量分别为0.16、0.18、0.20mL;第7组为对照组,每10g小鼠注射0.20mL的生理盐水。1.5tft1和mec4基因型检测采集32头断奶前仔猪的耳组织,用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。参考罗艳茹等和Li等,利用PCR-RFLP法筛选FUT1和MUC4基因均为粘附基因型的实验猪2头,处死后取其小肠黏膜上皮刷状缘细胞,作为细胞粘附实验的阳性对照。1.6刷状缘细胞的分离纯化小鼠/猪小肠黏膜上皮刷状缘细胞的制备:将仔猪/攻毒后的小鼠处死后,取空肠前段5~6cm置于放有低渗EDTA(5mmol/L)的培养皿中,纵向剪开,轻轻洗去粪便和碎屑;将剪开的空肠毛面朝上放在培养皿上,用一盖玻片轻轻刮擦肠黏膜表面以获取上皮细胞,并转移到装有2mL的低渗ED-TA溶液中的离心管中,4℃条件下放置30min;然后用移液器吹打,以使其尽量分散为单细胞;1200r/min离心10min沉淀刷状缘细胞;把沉淀的刷状缘细胞重悬于PBS溶液中洗涤2~3次,直至细胞悬液部分澄清,最后将刷状缘细胞重悬于1mL的PBS溶液中,加入叠氮钠和硫酸庆大霉素防腐,置于4℃保存备用。粘附实验:取大肠杆菌和刷状缘各0.1mL放于一离心管,加入甘露糖(0.4mg/mL)1μL,轻轻混合,室温培养30min,取1滴于载玻片用相差显微镜(OLYMPUS,日本)检测并拍照。单个刷状缘细胞的判断标准:粘附多于5个细菌为粘附。个体的判断标准:检测20个或更多的刷状缘细胞,80%以上的刷状缘细胞有5个以上的细菌与之结合为强粘附;至少有10%的刷状缘细胞有5个以上的细菌与之结合为粘附;少于10%的刷状缘结合多于5个细菌或多于10%的刷状缘细胞结合少于5个细菌为弱粘附;无结合判为非粘附。2结果与分析2.1细菌悬液浓度利用平皿稀释法对细菌悬液进行细菌计数,攻毒实验和粘附实验中所用的细菌悬液浓度分别为F4ab为5×109个/mL,F18ab为4×1012个/mL。2.2攻毒小鼠一般情况的变化腹腔注射2h以后,部分实验小鼠开始陆续有腹泻现象并可以持续2h左右。除观察到腹泻现象以外,发病的实验小鼠还表现为运动减少、聚堆、怕冷、不进食、毛松乱等现象。剖检发现,小鼠的十二指肠和空肠处出现充血现象。从表1和表2可以看出,攻毒后各组小鼠都有腹泻现象的发生,但随着注射剂量的增加,发生腹泻的小鼠数量没有明显变化。总体上,在本研究所采用的攻毒剂量条件下昆明白小鼠的腹泻率(69%)大于C57BL/6j小鼠(50%),攻毒大肠杆菌F4ab的腹泻率(63.75%)大于攻毒大肠杆菌F18ab的腹泻率(60%)。2.3骨移植的结果2.3.1刷状缘细胞的分离和鉴定利用PCR-RFLP技术从32头仔猪中筛选出2头易感基因型的仔猪,一头仔猪的MUC4基因型为GG,FUT1基因型为AG;另一头仔猪MUC4基因型为GC,FUT1基因型为GG。从图1A中可以看出,小肠上皮刷状缘细胞呈柱状,顶端为毛刷状的刷状缘。从图1B中可以看出,刷状缘上有大肠杆菌粘附。除了F4ab菌株外,还用F4ac、F4ad、F18ab、F18ac等菌株与猪肠黏膜上皮细胞进行细胞粘附实验,均观察到与F4ab菌株相同的粘附现象。2.3.2细胞粘连实验图2A是一个散在的、完整的小鼠小肠上皮刷状缘细胞,与图1A相比,猪与小鼠的小肠上皮刷状缘细胞在形态上是一致的。图2B是将大肠杆菌F4ab与昆明白小鼠的小肠上皮细胞一起培养后在显微镜下的观察结果,尽管周围有大肠杆菌,但是刷状缘上没有细菌粘附。和阳性对照一样,除了F4ab菌株外,还用F4ac、F4ad、F18ab、F18ac等菌株与昆明白小鼠肠黏膜上皮细胞进行细胞粘附实验,均未观察到粘附现象。为比较近交系和远交系小鼠的差异,本研究也分离了C57BL/6j小鼠的肠上皮细胞,并和上述5个菌株分别进行粘附实验,结果和远交系小鼠一样,均没有观察到粘附现象的发生。3小鼠腹泻现象的观察与研究本研究对小鼠进行了细菌攻毒实验,并进行小鼠小肠肠黏膜上皮细胞与大肠杆菌的粘附实验。赵荣山等使用大肠杆菌O111对昆明小鼠进行攻毒实验发现,经口感染到最高剂量也未出现腹泻现象,大便培养也未见致病性大肠杆菌生长;腹腔注射组在设计的剂量范围内呈梯度致病和死亡,大便细菌培养全部阳性。刘小宝等使用大肠杆菌K88ab对小鼠进行攻毒实验也发现同样的现象。Allen等研究表明,小鼠对ETEC(产肠毒素大肠杆菌)不易感,经口灌胃人源大肠杆菌后不会出现腹泻现象。考虑到此,本研究使用腹腔注射的方式来进行攻毒实验。在攻毒实验中,腹腔注射2h以后,实验小鼠开始有腹泻现象,腹泻现象可以持续2h左右。2h后就很难再观察到腹泻现象,这可能是因为攻毒后小鼠不再进食,腹泻排空了肠内容物,所以不会再有腹泻现象。但是无论是F4还是F18菌株随着剂量的增加腹泻率没有呈相应的增加,这可能是因为各组的注射剂量增加幅度过小所致。攻毒实验时,考虑到一般情况下近交系小鼠的抵抗力比远交系小鼠差,对近交系小鼠的注射剂量小,在本试验的攻毒实验结果中,昆明白小鼠的腹泻率(69%)大于C57BL/6j小鼠(50%),也许只是注射剂量造成的差异,而近交系和远交系小鼠对大肠杆菌F4和F18的易感性没有明显差别。本试验中,大肠杆菌攻毒实验后虽然观察到了腹泻现象,但在细胞粘附实验中却没有观察到粘附现象。在阳性对照中,猪的小肠上皮细胞与细菌是粘附的,证明本实验所用的细菌的菌毛表达没有问题,说明小鼠的小肠上皮细胞与本实验中所用的猪源大肠杆菌菌株确实不粘附。Allen等用人源ETEC大肠杆菌和小鼠的肠黏膜上皮细胞进行粘附实验,发现人源ETEC大肠杆菌对小鼠肠黏膜上皮细胞的粘附很弱,这和本实验结果相一致,说明小鼠对其他种属的致病性ETEC大肠杆菌易感性差。Savkovic等用人源EPEC大肠杆菌E2348/69与C57BL/6j小鼠肠上皮细胞系CMT-93