PCR扩增的原理和操作步骤

PCR扩增反映的操作第一节PCR扩增反映的基本原理一、聚合酶链式反映（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反映的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反映，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，涉及用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的状况下，用酶进行互补链的延伸，多次重复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合酶、Mg2+等。反映时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后减少溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至适宜温度，在TaqDNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反映的模板，如此重复变化温度，由高温变性、低温复性和适温延伸构成一种周期，重复循环，使目的基因得以快速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适宜温度下催化DNA链延伸合成（见图）。1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋构造的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，方便它与引物结合，为下轮反映作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，因此G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级构造的复杂性、G-C含量高低等都有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度能够采用972．模板DNA与引物的退火将反映混合物温度减少至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基构成。普通规定引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显着短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间普通为1～2min3．引物的延伸DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反映原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保存复制链”，并且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，TaqDNA聚合酶催化的合成速度大概为40～60个碱基/秒。通过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在后来的循环中，新合成的DNA都能够起模板作用，因此每一轮循环后来，DNA拷贝数就增加一倍。每完毕一种循环需2～4min，一次PCR通过30～40次循环，约2～3h。扩增早期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达成一定比值时，酶的催化反映趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”PCR的三个反映环节重复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反映最后的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表达平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反映中平均效率达不到理论值。反映早期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐步积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增加期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数状况下，平台期的到来是不可避免的。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一种原始模板为例，在第一种反映周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，确保了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎能够无视不计，这使得PCR的反映产物不需要再纯化，就能确保足够纯DNA片段供分析与检测用。变性延伸退火变性延伸退火图PCR的反映历程二、PCR反映的五个元素参加PCR反映的物质重要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。1．引物引物是PCR特异性反映的核心，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要懂得任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，运用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，另首先引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹构造，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反映（即错配）。引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计能够避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将极少甚至没有；而使用对的设计的引物得到的产物量可靠近于反映指数期的产量理论值。固然，即使有了好的引物，仍然需要进行反映条件的优化，例如调节Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵照某些原则，则有助于引物的设计。（1）引物长度PCR特异性普通通过引物长度和退火温度来控制。引物的长度普通为15-30bp，惯用的是18～27bp，但不应不不大于38bp。引物过短时会造成Tm值过低，在酶反映温度时不能与模板较好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超出酶反映的最适温度，还会造成其延伸温度不不大于74℃，不适于TaqDNA（2）引物碱基构成引物的G+C含量以40～60%为宜，过高或过低都不利于引发反映，上下游引物的GC含量不能相差太大。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，普通高于Tm值5～10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）预计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55～80℃，其Tm值最佳靠近72℃（3）引物二级构造引物二级构造涉及引物本身二聚体、发卡构造、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG不不大于kcal/mol或少于三个持续的碱基互补，由于此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定构造的可能性，引物中间或5’端的规定可适宜放宽。引物本身形成的发卡构造，也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡构造的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环构造形式亦有很大的关系。应尽量避免3’末端有发卡构造的引物。（4）引物3’端序列引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的成果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽量的少。如果3’末端的错配过多，通过减少反映的退火温度来赔偿这种错配不会有什么效果，反映几乎注定要失败。引物3’末端的另一种问题是避免一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，特别是在3’末端。引物间的互补将造成不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物本身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基构成决定，普通考虑末端5个碱基的ΔG。?G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链构造内部碱基对的相对稳定性，此值的大小对扩增有较大的影响。应当选用3’端?G值较低（绝对值不超出9），负值大，则3’末端稳定性高，扩增效率更高。引物的3’端的?G值过高，容易在错配位点形成双链构造并引发DNA聚合反映。需要注意的是，如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。另外末位碱基为A的错配效率明显高于其它3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A（5）引物的5′端引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，能够被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰涉及：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。对于引入一至两个酶切位点，应在后续方案设计完毕后拟定，便于后期的克隆实验，特别是在用于体现研究的目的基因的克隆工作中。（6）引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超出70%或有持续8个互补碱基同源，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。2．酶及其浓度TaqDNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中分离的。TaqDNA聚合酶是一种单亚基，分子量为94000Da。含有5’-->3的聚合酶活力，5’-->3’的外切核酸酶活力，无3’-->5’的外切核酸酶活力，会在3’末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（普通为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，TaqDNA聚合酶的出错率为10-4～10-5。此酶的发现使PCR广泛的被应用。此酶含有下列特点：（1）耐高温，在70℃下反映2小时后其残留活性在90%以上，在93℃下反映2小时后其残留活性是仍能保持60%，而在95℃下反映2（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反映的每轮循环完毕后再加新酶。（3）普通扩增的PCR产物长度可达kb，且特异性也较高。PCR的广泛应用得益于此酶，现在各试剂公司中开发了多个类型的Taq酶，有用于长片段扩增的酶，扩增加度极端可达40kb；有在常温条件下即可应用的常温PCR聚合酶；尚有针对不同实验对象的酶等。一典型的PCR反映约需的酶量为（总反映体积为50?l时），浓度过高可引发非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。3．dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有亲密关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。HCl的缓冲液将其pH调节到～，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反映中，dNTP应为50～200?mol/l，特别是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几个时（偏高或偏低），就会引发错配。浓度过低又会减少PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+4．模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的核心环节之一，传统的DNA纯化办法普通采用SDS和蛋白酶K来消化解决标本。SDS的重要功效是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿抽）抽提除去蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模板用于PCR反映。普通临床检测标本，可采用快速简便的办法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。模板DNA投入量对于细菌基因组DNA普通在1~10ng/?l，实验中模板浓度经常需要优化，普通可选择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一种梯度）。在PCR反映中，过高的模板投入量往往会造成PCR实验的失败。5．Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显着的影响，在普通的PCR反映中，多个dNTP浓度为200?mol/l时，Mg2+浓度为～l为宜。Mg2+浓度过高，反映特异性减少，出现非特异扩增，浓度过低会减少TaqDNA聚合酶的活性，使反映产物减少。普通厂商提供的TaqDNA聚合酶都有对应的缓冲液，而Mg2+也已添加，如果特殊实验应采用无Mg2+的缓冲液，，在PCR反映体系中添加一定量的Mg2+。三、PCR反映特点PCR反映含有下列特点：1．强特异性PCR反映的特异性决定因素为：（1）引物与模板DNA特异性的结合；（2）碱基配对原则；（3）TaqDNA聚合酶合成反映的忠实性；（4）靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的对的结合是核心，引物与模板的结合及引物链的延伸是遵照碱基配对原则的。聚合酶合成反映的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反映中模板与引物的结合(复性)能够在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的对的度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。2．高敏捷度PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12g）量级的起始待测模板扩增到微克（?g=10-6g）水平。能从100万个细胞中检出一种靶细胞；在病毒的检测中，PCR的敏捷度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3．快速简便PCR反映用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反映液加好后，即在PCR仪上进行变性－退火－延伸反映，反映普通在2～4小时完毕。扩增产物惯用电泳分析，操作简朴易推广，如采用特殊PCR仪（荧光时时定量PCR仪）则可全程监测PCR反映的成果，故耗时将更短。4．低纯度模板不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。第二节PCR扩增反映的实施一、PCR反映的条件PCR反映条件为温度、时间和循环次数。1．温度与时间的设立基于PCR原理三环节而设立变性-退火-延伸三个温度点。在原则反映中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再快速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，普通采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度（1）变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是造成PCR失败的最重要因素。普通状况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，由于高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会造成（2）退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基构成及其浓度，尚有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55Tm值（解链温度）=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范畴内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反映的特异性。复性时间普通为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。（3）延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：70～80℃，150核苷酸/S/酶分子；70℃，60核苷酸/S/酶分子；55℃，24核苷酸/S/酶分子；高于90℃（4）PCR反映的延伸温度普通选择在70～75℃之间，惯用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反映的时间，可根据待扩增片段的长度而定，普通1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min2．循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数重要取决于模板DNA的浓度，普通的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。二、PCR扩增产物分析PCR产物与否为特异性扩增，其成果与否精确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才干得出对的的结论。PCR产物的分析，可根据研究对象和目的不同而采用不同的分析办法。1．凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。（1）琼脂糖凝胶电泳：普通应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。2．酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用对应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。3．分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效办法。4．Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链（内部寡核苷酸）标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又能够提高检测PCR产物的敏捷度，还可知其分子量及条带形状，重要用于科研。5．斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，重要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。6．核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠办法。三、PCR成果异常分析PCR产物的电泳检测时间普通为48h以内，有些最佳于当天电泳检测，不不大于48h后带型不规则甚致消失。1．假阴性，不出现扩增条带PCR反映的核心环节有：①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量及活性；④PCR循环条件。寻找因素亦应针对上述环节进行分析研究。（1）模板：①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有Taq酶克制剂；③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化解决，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化解决液，其程序亦应固定不适宜随意更改。（2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析与否因酶的活性丧失或不够而造成假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度与否对称，是PCR失败或扩增条带不抱负、容易弥散的常见因素。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一种好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要重视引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，并且两引物带的亮度应大致一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，避免多次冻融或长久放冰箱冷藏部分，造成引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。（4）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可减少PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。（5）反映体积的变化：普通进行PCR扩增采用的体积为20?l、30?l、50?l或100?l,用多大致积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20?l后，再做大致积时，一定要模索条件，否则容易失败。（6）物理因素：变性对PCR扩增来说相称重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而减少特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而减少PCR扩增效率。有时尚有必要用原则的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的因素之一。（7）靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。2．假阳性出现