嗜冷菌检测方法

嗜冷菌检测方法嗜冷菌概念牛乳挤出来要经过冷却处理，降低乳温从而抑制细菌的生长繁殖，但在低温条件下有些细菌也能生长，而这类细菌即为低温菌。低温菌又包括嗜冷菌和耐冷菌。嗜冷菌主要存在于低温环境中，包括两类微生物，一类是专性嗜冷菌（Psychrophiles最高生长温度不高于20°C，最适生长温度为15°C，在0°C仍然可以生长繁殖的微生物；另一类为兼性嗜冷菌（PsychrotrophicS，又名耐冷菌，最高生长温度高于20C，最适生长温度高于15°C，在0〜5C仍然可以生长繁殖的微生物。专性嗜冷菌主要分布在常冷低温区，对温度的变化比较敏感，20C以上即很快引起死亡；而兼性嗜冷菌分布范围较宽，从常冷到不稳定的低温环境中都能分离到。方法一：基准法一6・5°C,培养10天（仲裁法）范围此方法用于原奶和巴氏杀菌奶的检验。方法提要准备好倒有培养基和定量稀释适当倍数的被测样品的培养皿。。2.2将培养皿在6.5C条件下培养10天。根据培养皿中的菌落数计算出每毫升样品中的菌落数，选择菌落数比较恰当的稀释倍数比较得当的培养皿进行菌落计数。试剂稀释液生理盐水：0.85％的氯化钠水溶液，灭菌。培养基平板计数琼脂23.5g+脱脂奶粉1g,溶于1000ml水中。必要时用滤纸过滤。调节pH值为6.9±0.1。将培养基分装倒入三角瓶中，每瓶100—150ml。在121土1°C下灭菌15min，如果培养基马上要用，用水浴锅冷却到46±1°C。如果不是，则为了不耽误培养基的使用，在实验开始前，将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷却到46±1°C。注：其中脱脂粉应该不含有抑菌剂。仪器及玻璃器皿微生物实验室常用仪器，制备和稀释样品所用仪器以及：4.1培养箱，可以调节并保持到6.5±0.5CpH计，带温度补偿，精度为0.14.3水浴，可以保持到46±1°C4.4三角瓶，250—300ml,带合适的塞子。4.5吸管，用嘴吸的吸管要用脱脂棉或纤维素塞紧。4.6培养皿，玻璃或塑料的，直径在90—100mm操作步骤5.1样品的稀释及培养5.1.1以无菌操作，将25ml样品注入含有225ml灭菌生理盐水的三角瓶内，充分混匀，制成1：10的稀释液。5.1.2用1ml灭菌吸管吸取1：10的稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，充分混匀，制成1：100的稀释液。5.1.3另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支吸管。5.1.4根据对样品污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。注：其他稀释方法可以使用，例如第一步稀释可以是10ml检测样品注入到90ml稀释液中，或11ml检测样品注入到99ml稀释液中。当样品和稀释液用量更大，方法的精密度和准确度就更高。5.1.5稀释液移入平皿后，应及时将凉至46C的培养基（可放置于46±1C水浴保温）注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。同时将培养基倾入空的灭菌平皿内作空白对照。注：从稀释样品到倾倒培养基，整个操作过程不应超过15min。5.1.6待培养基凝固，翻转平板，放入6.5C培养箱内培养10天。注：每叠皿不应超过6个，每叠皿之间以及与培养箱的壁之间应保持一定的间隙。菌落计数方法对平皿进行菌落计数时，应在柔和的光线下计数。为了便于计数，可使用适当的放大镜和（或）菌落计数器。以防极小的菌落遗漏，以及避免将平皿中杂质颗粒进行计数。仔细检查可疑的物质，如需要可使用更高倍数的放大镜，以区别

菌落和外来物质。菌落计数的报告平板菌落数的选择平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平板内若有链状菌落生长时（菌落之间无明显界限），若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。稀释度的选择及报告选取菌落数在10-300之间的培养皿作为计数的测定标准。若有两个稀释度，其生长的菌落数在10-300之间，则按下面的方法计数。计算每ml牛奶中微生物的个数N,用以下的公式：EcN=（n+0.1n）d12这里Ec：是所有皿上菌落数的总和。n:是第一个稀释度培养皿的个数。1n:是第二个稀释度培养皿的个数。2d：是与第一个稀释液相对应的稀释因子结果保留两位有效数字,后面的数字以四舍五入计算。当第三位数是5时,看其左边的数是奇偶数进行数字取舍；如28500进行数字取舍为28000,11500为12000。结果以科学计数法表示。举例微生物计数给出以下的结果（包括两个带盖培养皿）：在第一个稀释度（10E-2）：168和215个菌落在第二个稀释度（10E-3）：14和25个菌落Ec168+215+14+25422Ec168+215+14+25422=19182（n+0.1n）d[2+（0.1*2）]*10-20.02212根据上面所说结果进行取舍为19000,结果为1.9X104个/ml。注：如果有两个以上可以计数的稀释度，公式应修改为用多个稀释度进行计算。如为三个稀释度,由下面的公式可计算出每毫升中微生物的数量。EcN=（n1+0.1n2+0.01n3）d如果菌落数均小于10,则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数,报告每毫升牛奶菌落的估计数。如果菌落数均超过300,则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数,报告每毫升牛奶菌落的估计数。6、参考标准IDF标准101A：1991——乳中嗜冷菌的检验方法二：快速法一21°C，培养25h1范围本标准描述的是通过21C时快速菌落计数技术进行嗜冷菌菌数估算的方法。此方法用于原奶和巴氏杀菌奶的检验—当需要很快的得到嗜冷菌估算值的时候。2方法提要准备好倒有培养基和定量稀释适当倍数的被测样品的培养皿。2.2将培养皿在21C条件下培养25h。根据培养皿中的菌落数计算出每毫升样品中的菌落数,选择菌落数比较恰当的稀释倍数比较得当的培养皿进行菌落计数。3试剂稀释液生理盐水：0.85％的氯化钠水溶液,灭菌。培养基平板计数琼脂23.5計脱脂奶粉1g,溶于1000ml水中。必要时用滤纸过滤。调节pH值为6.9±0.1。将培养基分装倒入三角瓶中，每瓶100—150ml。在121±1°C下灭菌15min,如果培养基马上要用，用水浴锅冷却到46±1C。如果不是，则为了不耽误培养基的使用，在实验开始前，将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷却到46±1C。注：其中脱脂粉应该不含有抑菌剂。4仪器及玻璃器皿微生物实验室常用仪器，制备和稀释样品所用仪器以及：4.1培养箱，可以调节并保持到21±1°CpH计，带温度补偿，精度为0.14.3水浴，可以保持到46±1C4.4三角瓶，250—300ml，带合适的塞子。4.5吸管，用嘴吸的吸管要用脱脂棉或纤维素塞紧。4.6培养皿，玻璃或塑料的，直径在90—100mm5.操作步骤5.1样品的稀释及培养稀