桦褐孔菌总黄酮雪花膏的制备及性能研究

桦褐孔菌总黄酮雪花膏的制备及性能研究

桦树开花菌是一种寄生在落叶树上的菌，主要寄生在白桦、银桦、杨树等树干和树皮下，形成副作用的木腐菌。子实体是肿瘤，直径25.40厘米，黑色，深入裂纹，不规则。子的椭圆形和椭圆形是光滑的，有光泽和毛茸茸的。细菌肉是红茶。细菌管3.10mm，脆脆，前端开裂，菌孔6.8mm，圆形。桦褐孔菌的菌丝体极其耐寒,能耐受-40℃的低温,主要分布在北纬45～50°的北美、俄罗斯的西伯利亚、波兰、芬兰、中国黑龙江和吉林、日本北海道等地区。桦褐孔菌是一种民间药用真菌,东欧等多国广泛利用它来防治糖尿病、心脏病、癌症等各种疑难杂症,还可以抑制艾滋病病毒,抗辐射,抗有丝分裂、消除其活性等。桦褐孔菌富含黄酮成分。黄酮类物质又称作类黄酮物质,是色原烷或色原酮的衍生物,是以α-苯基苯并吡喃酮为主体的一系列物质的总称。黄酮类化合物具有抗衰老、抗肿瘤、抗氧化以及降血脂等多种生物活性,其中一种主要的生物活性是抗氧化作用,也就是减少自由基的产生和清除自由基。自由基对人体具有一定的生理作用,但体内自由基过多,就有可能会导致细胞或组织损伤、诱发多种疾病、加速动物机体的衰老。正常情况,人体自由基的生成和清除处在一个动态平衡。当机体处于某些疾病或外源性物质的入侵时,自由基的代谢会发生异常,产生过多自由基,而过多的自由基会造成体内氧化应激,引发疾病。若此时人体内的抗氧化物不足,无法清除过多的自由基,就会导致人体健康受损。作者从桦褐孔菌中提取总黄酮,并进行桦褐孔菌总黄酮雪花膏的抗氧化试验,为进一步研究桦褐孔菌总黄酮的生物活性和综合开发利用桦褐孔菌资源提供理论依据。1实验部分1.1主要设备和试剂1.1.1仪器、试药与仪器RE-2000B旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;美的KJ23B-DE第Ⅱ代微波炉,最大输出功率800W,广东省佛山市顺德区美的微波电器制造有限公司;UV-1100型紫外可见分光光度计,上海美普达仪器有限公司;GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱,上海汝源机电设备有限公司;DZF-6050型真空干燥箱,上海雷韵试验仪器制造有限公司;飞鸽牌TGL-16G高速冷冻离心机,北京海诚中仪科技有限公司。芦丁标准品,购自上海源叶生物科技有限公司;丙二醛(MDA)测定试剂盒、羟自由基测定试剂盒,购自南京建成生物工程研究所;其他试剂均为国产分析纯。1.1.2试验动物大白鼠,体质量130～160g,SPF级,SCXK-(闽)2008-0001,购自厦门大学医学院实验动物中心。1.2实验方法1.2.1标准曲线及合作标准方法的确定桦褐孔菌菌种由河北省科学院微生物研究所提供。将保存菌种接种在PDA试管综合培养基(马铃薯200.0g·L-1,葡萄糖20.0g·L-1配制)上,在28℃恒温培养箱中培养7～9d,活化后备用。采用液体培养法,用打孔器打下大小均匀一致的活性好的桦褐孔菌菌种接入液体培养基上,装入量为300mL的三角瓶装入150mL液体培养基,培养1d后转恒温培养振荡器上振荡培养(温度28℃,转速130r·min-1)。当菌丝体处于生长末期,发酵液倾出上清液,抽滤机抽滤后放烘箱中烘至恒重,烘箱温度为60℃。标准曲线的绘制:精确称取已烘干至恒重的芦丁标样20.00mg,微热溶解于体积分数为60%的乙醇溶液中,并定容至50mL,摇匀,即得质量浓度为0.4g·L-1的芦丁标准液。准确量取芦丁标准液0,1.0,2.0,3.0,4.0和5.0mL分别于25mL容量瓶中,然后各加入1.0mL质量分数为5%的NaNO2溶液,摇匀,放置6min。加入1.0mL质量分数为10%的AlCl3溶液,摇匀,放置6min。再加入10.0mL质量分数为4%的NaOH溶液。最后用体积分数为60%的乙醇溶液稀释至刻度,摇匀,放置15min。以试剂空白为参比,在510nm处测定吸光度,绘制标准曲线,得到回归方程为Y=4.3622X-0.0142,相关系数r=0.9996。式中Y为吸光度,X为黄酮质量浓度(g·L-1),n=6。桦褐孔菌总黄酮的微波提取:选择乙醇体积分数、料液比(g∶mL)、微波辐射时间、微波辐射功率为考察因素,选用L9(34)正交表进行试验(见表1),确定桦褐孔菌总黄酮微波提取的较佳提取工艺条件。总黄酮提取率=黄酮类化合物质量/干物料质量×100%。1.2.2酪氨酸酶法合成mllvain缓冲液在5组质量浓度为0.024g·L-1的不同体积(分别为5.0,7.0,7.5,8.0和12.0mL)的桦褐孔菌总黄酮提取液中加入0.025g酪氨酸和4mLpH=6.8的磷酸-柠檬酸mcllvains缓冲液,在37℃恒温水槽中预热10min,再加入4mL酪氨酸酶水溶液(以mcllvains缓冲液配制成0.05g·L-1),充分搅拌,于37℃反应15min后,测定其在475nm处的吸光度A1。另外,不加桦褐孔菌总黄酮提取液进行上述试验,测得吸光度A2。作为对照,在不加桦褐孔菌总黄酮提取液和酪氨酸的条件下再进行上述试验,测得吸光度A3。计算桦褐孔菌总黄酮对酪氨酸酶活性的抑制率I:I=(A2-A1)/(A2-A3)1.2.3桦褐孔菌总黄酮提取液tween油相:硬脂酸甘油酯3.00g,羊毛脂1.50g,蓖麻油3.00g,十六醇1.50g,十八醇2.50g;水相:三乙酸胺0.50g,甘油5.0g,Tween800.50g,蜂蜜1.00g,尼泊金乙酯0.30g,水30.00g,香精;质量浓度为0.024g·L-1的桦褐孔菌总黄酮提取液。前3相在水浴中从常温升到90℃,保持20min杀菌,将油相倒入水相(油相、水相都要保持均匀)。将不同体积的桦褐孔菌总黄酮提取液加入油相和水相的混合物中,搅拌,冷却至50℃,加入防腐剂,香精,调节pH=6.0～6.5(在50℃之前调好),取出放至室温,配制成一系列桦褐孔菌总黄酮雪花膏,并进行功能性测试。1.2.4温度稳定性将产品倒入3支洗净的干燥试管中,高度约80mm,1支放入40℃的恒温冰箱中,1支放入-5℃的恒温冰箱中,24h后取出,待恢复室温后将其与第3支试管(存放于室温)中的样品进行比较,观察其对温度的稳定性。并进行提取液与雪花膏的相容性试验。1.2.5桦褐孔菌总黄酮雪花膏对正常大白鼠皮肤组织匀浆的稳定性的影响实验将40只大白鼠分成4组,每组10只,去其背部被毛,暴露面积约为6cm2,前3组用0.024g·L-1的桦褐孔菌总黄酮提取液加入量为0,7.5和8.0mL所配的雪花膏每天涂抹一定时间,30d后处死,取背部皮肤组织匀浆,第4组不做雪花膏涂抹实验。制备10%皮肤组织匀浆液,分别测定桦褐孔菌总黄酮雪花膏对正常大白鼠皮肤组织匀浆中MDA的含量。具体方法参照MDA测定试剂盒说明书。1.2.6酶活力的测定超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的测定参照邻苯三酚微量进样法,测定波长为325nm,温度为25℃,SOD酶活力单位采用U表示。邻苯三酚自氧化速率的测定:参照文献,在试管中加入缓冲液(0.1mol·L-1的Tris-HCl,pH=8.2,内含2mmol·L-1的EDTA),于25℃恒温水浴中保温20min,然后加入邻苯三酚(对照管用10mmol·L-1的HCl代替邻苯三酚),迅速摇匀,立即倾入比色杯,在325nm波长下测定吸光度A,每隔30s读数1次,连续测2min,要求自氧化速率控制在0.070A·min-1。SOD或粗酶抽提液的活性测定方法与测定邻苯三酚自氧化速率相同。酶活力单位定义:在一定条件下,1mL的反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。每毫升酶液活性单位(U⋅mL−1)=v0−v150%v0×V×(N/V1)(U⋅mL-1)=v0-v150%v0×V×(Ν/V1)式中v0为邻苯三酚自氧化速率;v1为酶样液氧化速率;V为反应液总体积;N为酶样液稀释倍数;V1为酶样液体积。1.2.7皮肤组织匀浆中羟自由基清除能力的测定按照羟自由基测定试剂盒说明书的方法,测定体外皮肤组织匀浆液在550nm处的吸光度,并计算皮肤组织匀浆中羟自由基清除能力。具体方法参照羟自由基测定试剂盒说明书。2结果与讨论2.1工艺条件优选如表2所示,各因素对总黄酮提取率的影响程度依次为:微波辐射功率>料液比>乙醇体积分数>微波辐射时间;较佳的工艺条件为A2B1C1D2,即乙醇体积分数为70%,料液比(g∶mL)为1∶40,微波辐射时间为120s,功率为352W。在较佳提取工艺下进行3次重复试验,最高提取率为4.96%。2.2美白剂的活性测试酪氨酸酶是黑色素细胞合成反应的限速酶,具有酪氨酸羟基酶和多巴羟基酶2方面的活性。酪氨酸酶催化酪氨酸生成多巴,多巴转化生成多巴醌,多巴醌呈红褐色,在475nm处有最大吸收,利用分光光度计测定加入美白剂和未加美白剂反应中生成多巴醌的变化来检测美白剂对酪氨酸酶活性的抑制率。样品对酪氨酸酶活性的抑制率越高,美白效果越明显。表3结果表明,质量浓度为0.024g·L-1的桦褐孔菌总黄酮提取液加入量为7.5mL时,酪氨酸酶活性的抑制效果较好,抑制率为25.0%。2.3不同结构黄酮雪花膏的其它性能所制备的雪花膏在室温,40和-5℃存放24h后发现无分层、沉淀、变色现象,由此可见桦褐孔菌总黄酮雪花膏的耐热、耐寒性能好,对温度较稳定。由表4可以看出,桦褐孔菌总黄酮提取液对雪花膏的稳定性、光泽、气味、颜色、pH影响不大,可见桦褐孔菌总黄酮提取液与其他组分有很好的相容性。质量浓度为0.024g·L-1的桦褐孔菌总黄酮提取液用量为7.5mL时制成的雪花膏的色泽等效果最好。2.4皮肤组织匀浆中mda含量的变化现代医学认为,皮肤老化是自由基产生和消除发生障碍的结果。机体每天代谢时产生的自由基分子在正常情况下可被清除,但年龄的增长可以加速氧自由基的形成。自由基形成后,其代谢产物丙二醛(MDA)含量明显增高,MDA为极活泼的交联剂,它能使真皮结构发生大分子交联,使真皮纤维扭曲、增粗、紊乱,使人的皮肤在外观上日见衰老。其吸光度值A的高低可间接表征物质的抗脂质过氧化(即抗MDA生成)活性,A值越小,表明物质的抗脂质过氧化能力越强;反之,则抗脂质过氧化能力越弱。如表5所示,与对照组(无涂抹雪花膏)相比,涂抹了雪花膏的大白鼠皮肤组织匀浆中MDA含量显著减少;并且在涂抹了雪花膏的大白鼠中,随着桦褐孔菌总黄酮提取液用量增加,大白鼠皮肤组织匀浆中MDA含量显著减少,加入质量浓度为0.024g·L-1的桦褐孔菌总黄酮提取液分别为7.5和8.0mL时,MDA生成抑制率分别为45.87%和52.98%,与不加桦褐孔菌总黄酮提取液的相比,差异均达到极显著水平(P<0.01),表现出良好的剂量-效应关系。可见较高浓度的桦褐孔菌总黄酮可增强MDA生成的抑制率。2.5剂量-效应关系研究超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内重要的抗氧化酶,能清除超氧阴离子自由基(O2-·),其在生物体内的水平高低是衰老与死亡的直观指标。如表6所示,与对照组(无涂抹雪花膏)相比,涂抹了雪花膏的大白鼠皮肤组织匀浆中SOD活性显著增强;并且在涂抹了雪花膏的大白鼠中,随着桦褐孔菌总黄酮提取液用量增加,大白鼠皮肤组织匀浆中SOD活性也增加,加入质量浓度为0.024g·L-1的桦褐孔菌总黄酮提取液分别为7.5和8.0mL时,SOD活性分别为144.69和160.15U·mL-1,与不加桦褐孔菌总黄酮提取液的相比,均达到极显著差异(P<0.01),并表现出良好的剂量-效应关系。说明随桦褐孔菌总黄酮浓度的增加,大白鼠皮肤的SOD活性有明显地增强。2.6皮肤组织匀浆中羟自由基清除能力的变化羟自由基(·OH)是生物体内危害最大、活性最强的自由基,它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用,造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤,使细胞坏死或突变,其还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关。因此,清除羟自由基能力是反映试样抗氧化作用的重要指标。如表7所示,与对照组(无涂抹雪花膏)相比,涂抹了雪花膏的大白鼠皮肤组织匀浆中羟自由基清除能力显著增强;并且在涂抹了雪花膏的的大白鼠中,随着桦褐孔菌总黄酮提取液用量增加,大白鼠皮肤组织匀浆中羟自由基清除能力均有显著增强,也表现出良好的剂量-效应关系。说明随桦褐孔菌总黄酮浓度的增加,清除羟自由基的作用有明显地增强。3结论1桦褐孔菌总黄酮雪花膏乙醇体积分数为70%,料液比(g∶mL)为1∶40,微波辐射时间为120s,功率为352W;最高提取率为4.96%。桦褐孔菌总黄酮具有一定的抑制酪氨酸酶活性的能力,在一定浓度梯度的酪氨酸酶抑制试验中,7.5mL桦褐孔菌总黄酮提取液抑制效果最好,抑制率为25.0%。桦褐孔菌总黄酮雪花膏的物理性能测试显示,当加入质量浓度为0.024g·L-1的桦褐孔菌总黄酮提取液7.5mL时,该雪花膏对光照较为稳定,耐热、耐寒性能良好;且雪花膏的