马铃薯叶片愈伤组织诱导和再生的研究

马铃薯叶片愈伤组织诱导和再生的研究

甘薯是世界上最重要的经济和粮食之一，分布在许多国家和地区。目前我国马铃薯种植面积居世界第一。近年来,随着基因工程技术在作物育种中的广泛应用,转基因技术日趋成熟。建立高效的马铃薯再生系统是转化成功与否的关键。基因型对植株再生有明显影响,这在很多作物中都有报道。张建全在试验的9个马铃薯品种中,发现只有“大西洋”出现芽的分化,其它品种的愈伤组织只形成一些不规则的瘤状突起,不能分化出正常植株;李凤云等研究了10个马铃薯品种无腋芽茎段的愈伤诱导和再生情况,发现品种间的差异达到极显著水平,愈伤组织诱导率的变幅在38.0%～98.7%之间,再生率的变幅为2.1%～90.3%。巩慧玲等以多种双单倍体马铃薯和普通栽培种马铃薯的不同外植体作为遗传转化受体材料时发现,仅在Atlantic、Snowden两个普通栽培材料中获得转化植株。培养基中激素浓度也是影响再生频率的重要因素之一。激素对愈伤诱导率和芽分化率的影响体现在激素种类、激素浓度和不同激素之间的适当配比。张宁等在试验中设置了5个激素组合,发现2mg/L6-BA和2mg/LNAA组合诱导“费乌瑞它”叶盘愈伤诱导率最高,但在5种培养基上的芽分化率均为0%。本文对经农杆菌转化后马铃薯叶片再生过程中的一些影响因素,如品种、激素等进行了探讨,为马铃薯转基因育种工作奠定基础。1材料和方法1.1培养基的制备试验中使用的马铃薯品种“费乌瑞它”、“东农303”、“中薯1号”、“中薯3号”(组培苗从中国农科院蔬菜花卉所购进)及加拿大品种“RussetBurbank”(由南京农业大学提供)的试管苗,通过组织培养继代繁殖。继代繁殖中使用的培养基为MS基本培养基附加0.6%琼脂和3%蔗糖,pH5.8。农杆菌为LBA4404,表达载体为pBI121质粒,含的抗性选择标记基因为卡那霉素(Km)抗性基因nptⅡ。1.2诱导芽的培养选取生长健壮,苗龄21～28d周左右的叶片,切成0.4～0.5cm2大小的块状,作为转化外植体。叶块预培养2d,再用含目的基因的农杆菌侵染后共培养2d,转入愈伤诱导培养基中进行培养(表1);14～21d后,转入B0A培养基诱导芽的形成。待芽长至2～3cm后,将其切下接种到生根培养基上生根。光照强度为12000lx,光周期为12h光照/12h黑暗,培养温度(22±1)℃。试验比较了不同基因型和激素浓度及组合对愈伤组织和芽分化的影响。1.3愈伤诱导率分别在愈伤组织诱导培养基上培养14d和在芽分化培养基上培养14～21d,统计出愈块数、分化芽块数和每块芽数,计算愈伤诱导率(出愈块数/接种块数×100%),芽分化率(分化芽块数/出愈块数×100%)和每块芽数(分化芽数/分化芽块数)。2结果与分析2.1“东农243”的愈伤诱导率试验比较了4个品种愈伤诱导率和芽分化率。经农杆菌转化的4个品种叶盘外植体在AA培养基培养19天后调查诱导愈伤率,结果表明,“东农303”的愈伤诱导率最高,为64.77%,“中薯3号”最低,只有27.78%。然后转入B0A培养14天后调查,“RussetBurbank”的愈伤诱导率达95.83%,“费乌瑞它”最低,为72.22%;芽分化率则是“费乌瑞它”最高,为11.54%;“RussetBurbank”为4.39%,“中薯3号”在这段时间内没有出芽(表2)。2.2不同处理的愈伤诱导率、芽分化率和每芽数对5.试验设置了6个6-BA和NAA浓度处理,比较“RussetBurbank”品种愈伤形成和芽分化情况。表3结果表明,不同处理的愈伤诱导率、芽分化率和每块芽数有很大差异。愈伤诱导率以BB和BC处理最高,达100%;芽分化率则是AA和BB处理最高,分别为64.00%和48.39%;每块芽数最多的是BA处理,约4.33个芽,出芽最少的是AB处理,约1.33个芽。这个结果表明,在我们的试验中愈伤诱导率、芽分化率和每块芽数之间相关性不大。2.3“东农243”在aa中愈伤诱导率在愈伤诱导培养基中设置了3个NAA浓度处理(0.1、0.3、0.5mg/L),比较不同品种的反应。从表4看,各品种在3种培养基中的愈伤诱导率均存在很大差异。经3种不同NAA浓度培养基培养16d时调查愈伤诱导率,结果表明,“东农303”在AA中愈伤诱导率最高,其它3个品种在AE中愈伤诱导率最高。从品种平均值来看,“中薯1号”的愈伤诱导率最高,为69.39%,最低的是“东农303”为33.33%。将所有外植体(包括出愈伤和未出愈伤的)接入B0A培养17天后调查,发现随着培养时间的延长,各处理愈伤诱导率均有所提高,且所有参试品种均以AE处理的愈伤诱导率最高(“中薯1号”的AC和AE均为100%)。从品种的角度来进行比较,愈伤平均诱导率以“中薯1号”最高,为97.50%;最低的还是“东农303”,只有52.17%。在参试品种中,仅“中薯1号”经AA、AC两种培养基培养的外植体分化出芽最早,AC处理的芽分化率最高,而其它品种的处理在B0A培养17d时均没有出芽。2.4抗km根选生根在植株再生过程中,试管苗生根也是一个重要环节。尽管整个转化再生过程是在含Km的培养基中进行,我们还是对再生苗进行了两次抗Km根选。与非转基因不定芽对照相比,接入含MS+50mg/LKm培养基中的转基因不定芽大部分能生根,根数5～6条;而对照在相同的培养基中则全部不能生根,只有少量气生根,植株生长矮小。本试验共得到约100个转基因株系,500多个单株。表5为不同品种再生芽两次根选生根率的比较。不同品种第1次根选的生根率约为65%～73%;所有品种第2次生根率都比第一次略高。2.5愈伤组织的诱导图1为转基因马铃薯植株再生过程。将经过与农杆菌共培养2d的叶盘外植体接种到含有50mg/LKm和500mg/LCb的愈伤组织诱导培养基上,培养约14d后,在叶盘边缘处可见有瘤状突起;将其转入芽分化培养基B0A诱导形成不定芽;当不定芽长至2～3cm高时,将其转入生根培养基MS+50mg/LKm上生根;最后,将生根良好的试管苗转移盆栽。3对外源基因的诱导效果探讨了基因型和激素浓度对马铃薯转基因植株再生的影响。农杆菌介导的植物遗传转化的转化频率与植物的基因型有很大关系,基因型依赖性是植物遗传转化的限制因素。本试验结果表明,在同一培养基中,不同品种之间愈伤诱导率和芽诱导率均有很大差异。其次,“费乌瑞它”、“东农303”的叶片在愈伤诱导过程中较易黄化,“中薯1号”叶片则保绿效果好,这也说明马铃薯基因型差异对愈伤组织诱导效果的影响明显,而且不同品种由于对农杆菌的敏感性不同会有转化效率的差异。这与前人报道马铃薯再生对基因型的依赖性是一致的。马铃薯不同品种愈伤诱导和芽分化所需的激素种类和浓度不同。试验结果已充分证实了这一点。从试验结果来看,“费乌瑞它”、“东农303”、“中薯1号”、“中薯3号”等品种在6-BA浓度一致、培养时间较长的情况下(28d以后),均以NAA0.5mg/L愈伤组织的诱导效果较好。本试验“费乌瑞它”、“东农303”的结果与李娟等报道的有一定差异,这可能是本试验转化的外源基因影响其分化率。试验中我们发现,在诱导培养基中没有出愈伤的外植体转入B0A中有愈伤分化,这种情况在品种“RussetBurbank”和“中薯3号”表现较为突出。愈伤出现的早晚与芽的分化高低之间是否有关联,这有待于进一步的研究。此外我们的试验结果表明,马铃薯叶片的愈伤诱导率、芽分化率和每块芽数之间相关性不大,既并不是愈伤诱导率高的品种或处理,芽分化率就高;芽分化率最高的品种或处理,每块芽数并不一定很高