酶免疫技术讲义

标记免疫技术标记免疫技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术LabeledImmunoassaysDesignedforAgsandAbsthatDONOTreactinprecipitationoragglutinationtestsduetotheirsmallsizeorlowconcentrations.

Indirectmethodofdetection:常用的免疫标记物质类别标记物用途荧光素FITC、RB200、TRITC免疫组化镧系元素螯合物免疫分析测定放射性核素

3H、14C、32P、57Gr免疫分析测定

125I、131I酶HRP、AP免疫组化免疫分析测定化学发光物Luminol、lucigenin免疫分析测定金属颗粒胶体金、铁蛋白免疫组化免疫分析测定

1、酶免疫技术2、荧光免疫技术3、放射免疫技术4、发光免疫技术5、金免疫技术按指示标记物质划分的类型1、免疫测定技术2、免疫组化技术按测定用途划分的类型临床免疫学检验第5版

第八章

酶免疫技术

利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。基本原理

基本特点：

①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性。②酶促反应专一性，保证特异性。③底物反应放大作用，提高敏感性。④酶标试剂保存稳定。⑤操作简便，安全易行。酶免疫技术的分类

酶免疫组化用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体

酶免疫技术均相酶免疫测定酶免疫测定固相酶免疫测定异相酶免疫测定（ELISA）液相酶免疫测定均相型（homogenous）异相型（heterogeneous）（一）酶与酶作用底物1.用于标记酶的要求：酶活性高标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性酶催化底物后信号易判定或测定酶活性不受样品中其他成分的影响酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安全无害，价廉酶免疫技术的技术要点

2.常用酶及其底物（1）辣根过氧化物酶（HRP）

常用底物：邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应避光，应用液稳定性差，需新鲜配制，致癌性。四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差。（2）碱性磷酸酶（AP）

常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPP），产物为黄色。

*AP灵敏性高与HRP，可从大肠杆菌和小肠粘膜提取，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。（二）酶标记抗体或抗原基本要求：

酶标记抗原纯度要高，抗原性完整；抗体的特异性好，效价高，亲和力强，比活性高以及易于批量生产和分离纯化。酶标记方法

1.交联法

以双功能交联剂为“桥”，分别与酶和抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二醛交联法（分别与抗原和抗体的氨基结合）。2.直接法

用过碘酸钠活化酶蛋白分子后（使多糖羟基氧化为醛基），再与抗体（抗原）的游离氨基结合。仅适用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）标记物制备。标记免疫物的分离与鉴定1、分离目的：去除游离酶方法：盐析、柱层析2、鉴定抗体活性酶活性酶标记率（分光光度法,E/P一般为1~2)（三）固相载体基本要求结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法简便易行、快捷经济。种类与选择1.塑料制品（聚苯乙烯，聚氯乙烯2.微颗粒（高分子单体聚合物）3.膜载体（硝酸纤维素膜，尼龙膜和玻璃纤维素膜）第三节、酶联免疫吸附试验

(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)ELISA

understandingtheacronymEL Enzyme-linkedAnenzyme’sactivityisusedasa“reporter”totestforthepresence/amountofaproteinofinterest.Theenzymaticreactionwillproduceacoloredspecies.

ELISA

understandingtheacronymEL Enzyme-linkedIS ImmunosorbentAnantibodyorantigen(“immuno”)isadsorbed(“sorbent”)ontothepolystyrenewellsinwhichweconductthetest.OneantibodyisalreadyadsorbedaddedtothewellsandasecondantibodywithourenzymewillbeaddedinthetypeofELISAwewillperformtoday.

使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗体的形成）

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）基本原理：用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离）

加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应）（二）ELISA技术类型：ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。1．双抗体夹心法特点：非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇

血清标本中有类风湿因子存在，则可出现假阳性反应。在双抗体夹心法基础上，进一步发展了双位点一步法。该法使用针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的决定簇的两种单克隆抗体，即包被使用一种单抗，酶标记使用另一种单抗。测定时将含待测抗原标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经过一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。2．双位点一步法3．间接法间接法由于采用的酶标抗抗体仅针对一类免疫球蛋白分子，通常用的都是抗人IgG，所测的仅为抗体的IgG类，不涉及IgA和IgM类。只需更换固相抗原，就可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。容易受血清中高浓度的非特异性IgG的干扰，通常待测标本需经一定稀释后才能测定。4、双抗原夹心法此法可检测各类抗体，因此双抗原夹心法的灵敏度和特异性要高于间接法。起原理类似双抗体夹心法，操作步骤也基本相同，也可采用一步法，只不过由于机体产生抗体的效价有限，一般不会出现钩状效应。5.竞争法特点：用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的浓度成反比。竞争法测抗体的注意点抗体的检测一般不采用竞争法，但当相应抗原材料中含有与抗人IgG反应的物质，而且不易得到足够的纯化抗原或抗原的结合特异性不稳定时，可采用此法。不同于单个抗原决定簇的小分子抗原的竞争法，其测定的可靠性受竞争抗体的特异性和亲和性的影响，特异性及亲和性越接近，测定的可靠性越强。EEEEEEEEEE竞争法检测HBcAb示意图竞争法检测HBeAb示意图固相抗原标本（含抗体）酶标抗体底物固相抗体标本（含抗体）酶标抗体底物抗原6.捕获法（反向间接法）

主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。捕获法的注意事项RF(IgM类)能与固相上的抗人IgM抗体结合，并与随后加入的酶标抗体（动物IgG)反应,出现假阳性反应。非特异IgM在第一步温育中可与特异性IgM竞争与固相抗体结合，影响测定的灵敏度。因此使用捕获法测IgM时，一般都要对临床标本进行适当稀释，减少非特异性IgM的干扰。双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗原的方法竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清和酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）双位点一步法（注意钩状效应的影响）间接法：用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。双抗原夹心法（也可采用一步法）：用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标抗原，加底物显色。应用：乙型肝炎表面抗体竞争法：用已知抗原包被，加入待测血清同时加酶标抗体，加底物显色。应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测ELISA检测抗体的方法操作注意事项：加样

应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。保温

1、一般均采用水浴箱，使温度迅速平衡。

2、为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。洗涤：

决定着实验的成败。目的：洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种。比色

比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。用特定的波长测读吸光值。

比色结果的表达以往通用光密度（opticaldensity，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。Howwewilldetect:

readabsorbanceat450nm均相酶免疫测定

基本原理：利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记