质量标准中有关物质测定方法的建立

药品研究及生产过程中有关物质的控制方法和要求

化学二室谢沐风2005年4月1有关物质的来源原料药合成过程中带入;制剂过程中产生;或是在贮藏、运输、使用过程中产生。控制的必要性2

有关物质的测定方法

仪器角度：

高效液相色谱法（HPLC法）、薄层色谱法（TLC法）、紫外分光光度法（UV法）、气相色谱法（GC法）、毛细管电泳色谱法（CE）等

试验角度：对照品法自身（稀释）对照法归一化法3有关物质的计算方法杂质对照品法加响应因子（即重量校正因子）计算的自身对照法、

不加响应因子计算的自身对照法根据不同杂质采用不同方法等。有关物质的计算方法定量检测和限度检测4高效液相色谱法（HPLC法）1.色谱条件的确定（即专属性试验）专属性是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，通常采用在纯物质（原料或制剂）中加入一定量的杂质或辅料，证明各杂质均可与被分析物分离。配制含有1%(w/w)浓度各中间体（即各杂质）的主成分对照品溶液作为系统适用性试验用溶液，来确证色谱条件的适用性。

5专属性试验验证图谱62.检测波长的确定

涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分）选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得到错误的判断。目前国外有关该项研究的进展73.供试品溶液浓度的确定

（灵敏度试验——最低检出量的测定）供试品溶液浓度的设定至关重要。通常其设定是依据最低检出量和最大进样量来进行的。最低检出量虽然是个绝对值，但其真正的意义确是其相对值，即相对于供试品溶液中样品浓度的多少而言。

其测定方法分为直观评价法和依据信躁比两种方法。最大进样量以不断增加样品溶液浓度，直至被分析物不拖尾的浓度为准。83.供试品溶液浓度的确定设定杂质总量不得过1.0%，最低检出量通常需达到对照溶液浓度的1/10~1/50（即相当于供试品溶液浓度的0.1%~0.02%）。也就是说供试品溶液的浓度至少是最低检出量的1000倍~20000倍，又由于最低检出量受各因素的不同而改变（即耐受性因数），故供试品溶液的浓度在保证不拖尾的情况下（即小于最大进样量），可在此基础上再设定的高一些，以保证该浓度可适用各种条件。93.供试品溶液浓度的确定举例说明：进样量为20μl，主成分的最低检出量为1μg/ml（以浓度表示），规定杂质限度为1%，此时供试品溶液的浓度可设定为1mg/ml~20mg/ml，或者再高一些，但始终需保持主成分峰不拖尾为准，即不超过最大进样量。拖尾情况也可通过流速进行适当调节103.供试品溶液浓度的确定114.加样回收试验（即准确性试验）准确性试验可采用样品中加入已知量杂质的方式来评价。准确称量各杂质，将含有1%(w/w)浓度的各杂质加入到样品溶液中，以验证所采用的色谱条件是否可分离检出出相应的各杂质。该原理同前面所述的专属性研究是一致的。125.流速、柱温与溶剂的选择在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些，且使主成分峰不拖尾即可。柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。136.积分参数的设定积分参数的设定是非常重要的。它主要由斜率(Slope)、峰宽(Width)、最小峰面积(MinArea)组成。采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同一斜率、峰宽下进行积分计算。这里主要是供试品溶液的最小峰面积设定，它将直接导致测定结果。设定的太小，会导致很多小峰甚至是基线漂移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质峰面积增加，易判断为不合格；如设定的太大，又将反应不出杂质的存在情况。146.最小峰面积的设定其设定，不是绝对值，而是相对值。英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。普通样品测定时，通常为1/10~1/20（即相当于样品测定浓度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。同时请大家注意，在进行原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。157.保留时间的设定经过上述方法学认证后，确定供试品溶液的保留时间，通常以洗脱出全部杂质和经强力破坏试验出的杂质，规定至主成分保留时间的几倍为止。168.强力破坏试验水破坏取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。氧化破坏取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在90℃放置24小时。强碱破坏取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在90℃放置24小时。强酸破坏取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在90℃放置24小时。高温破坏取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温下破坏至外观性状改变强光破坏取原料适量，置紫外灯下照射48小时。179.定量检测

如有关物质的检查为定量检测，即为杂质对照品法，在上述项目的各项研究后，需增加线性试验以及一些必要的方法论证项目。1810.HPLC/UV二极管阵列检测器采用二极管阵列检测器进行论证，也是目前常采用的一个强有力的手段。它通过对一个色谱峰的几点进行紫外扫描，然后比较所得到的扫描图谱的接近程度从而评价被检测峰的纯度。我室有一台该检测器，曾多次做过该方面的工作。19薄层色谱法薄层色谱法由于既可检测