遗传学教学课件：09 第九章 基因工程和基因组学1

第九章基因工程和基因组学第一节基因工程

1.遗传工程广义：细胞工程如体细胞、原生质体的培养与杂交细胞器工程细胞核的移植：回交，克隆羊染色体工程整条染色体或染色体片断的切割或转移。基因工程狭义：基因工程：体外不经过有性繁殖，有目的地使DNA发生重组的技术体系。故又称重组DNA技术。2.克隆（clone）

n.无性繁殖系：无性繁殖系，遗传物质来源和组成完全相同。

v.获得无性繁殖系的过程－即获得某种特异DNA片段，并大量扩增的过程。发展历史1971年史密斯（SmithH.O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始1972年伯格（BergP.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和λ噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来得到新的DNA分子1973年科恩（CohenS.）等进一步将酶切DNA分子与质粒DNA连接起来，并将重组质粒转入E.cloi细胞中1982年美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场1985年转基因植物获得成功1986年Mullis发明了PCR技术，专利转让达3亿美元1990年9月14日是基因治疗的诞生日在美国马里兰州的一个医疗中心进行第一例基因治疗临床试验。一个4岁的小女孩(A.DeSilva)，患有严重综合免疫缺失症（SCID）。将腺苷酸脱氨酶（ADA）基因转入骨髓细胞，再送回病人体内，基因治疗SCID获得初步效果发展历史1994年延熟保鲜的转基因番茄商品生产1996年威尔穆特研究小组克隆羊“多莉”诞生（利用6岁成年母羊乳腺细胞）1997年威尔穆特小组报道用胎儿细胞为核供体，获得了表达治疗人血友病的凝血因子IX转基因克隆羊“波莉”1998年美国夏威夷大学用一只实验鼠的细胞克隆了3代共50只实验鼠2000年美国用无性繁殖技术克隆猴子“泰特拉”，意味克隆人体已无技术障碍2001年美国宣布首次克隆成功处于早期阶段的人体胚胎2002年法国研究者宣布克隆出第一个女婴，但一直未获证实

一、基因工程的内容分：从细胞和组织中分离DNA切：利用能识别特异DNA序列的限制性内切核酸酶切割DNA分子，制备DNA片段接：将酶切的DNA片段与载体DNA连接，构建重组DNA分子转：将重组DNA分子导入宿主细胞，并在细胞内复制产生多个完全相同的拷贝，即克隆(clone)筛：从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞及目的基因表:克隆的DNA能转录成mRNA、翻译成蛋白质SDS法SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种键。CTAB法CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。DNA提取方法基因工程的工具及技术剪刀:限制酶

Restrictionenzyme浆糊:连接酶Ligase载体:Vecter重组子转化方法1.以基因克隆为目的的转化方法氯化钙转化法

电激法2.以基因表达为目的的转化方法直接法：氯化钙转化、原生质体、基因枪间接法：农杆菌介导、病毒介导二、限制性内切核酸酶限制性内切酶(restrictionenzyme)：一种水解DNA的磷酸二脂酶，遗传工程中重要工具。细菌细胞中存在限制修饰系统：限制：降解外源DNA，防御异源遗传信息进入的手段修饰：修饰外源DNA片段后，保留在新细胞中限制性内切酶的命名：根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示；①.EcoR

I来自大肠杆菌（Escherichiacoli）；②.Hind

Ⅲ来自嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）。限制性内切酶的类别：第Ⅰ类酶（切割部位无特异性）：如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300000)，作用时需ATP、Mg++等辅助因子。第Ⅱ类酶（切割部位有特异性）：如EcoR

I(大肠杆菌)、HindⅢ(嗜血杆菌)，分子量较小(约20000~100000)，作用时需Mg++存在。类型：

I型：特异识别位点，但切割位点随机。需要ATP、

Mg2+等。基因工程中无用：EcoB;EcoK

II型:特异识别位点和切割位点。只需Mg2+。识别位点：回文对称序列（palindrome）粘性末端：EcoRIHindIII：5’突出

NotIPstI3’突出平头末端：SmaIEcoRI:HindIII:

5’3’GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGAATTCGCTTAAGAAGCTTAAGCTTTTCGAATTCGAAAGCTTAATTCGA5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’PstISmaICTGCAGCTGCAGGACGTCGACGTCGCTGCAACGTCG5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’CCCGGGCCCGGGGGGCCCGGGCCCGGGCCCCCCGGG三、载体作为载体DNA分子，需要具备以下条件：具有复制原点（ori），在宿主细胞中能自我复制并带动外源DNA复制，稳定保持。具有多克隆位点（MCS），即有多种限制酶切位点，每一种酶的切点只有一个，且与载体的复制原点和标记基因位点无关。至少有一个可以作为重组DNA分子筛选的标记基因，且寄主没有这种基因。容易从寄主中分离回收类型：细菌质粒λ噬菌体柯斯质粒穿梭载体细菌人工染色体(BAC)酵母人工染色体(YAC)Ti质粒及其衍生载体

等(1)细菌质粒(plasmid)质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。质粒具有重组表型检测标记，检测是否携带外源DNA片段。在细胞内的复制程度：严紧型：一个细菌细胞内质粒数量有1～2个；松驰型：每个细胞内有的20～60个如pUC18质粒具有以下特点：分子量小，可接受较大外源片段；拷贝数多，500个／细胞；克隆位点的酶切位点多，克隆方便；具有用于检测重组质粒的选择标记（α–互补的显色表型）。(2)λ噬菌体噬菌体DNA中间约2/3的序列为中间基因簇，两端为DNA左、右臂。中间基因簇可被外源DNA替代而不影响侵染细菌能力易操作、阳性克隆多承载15-23kb优点：不易引起生物危害，有助于“目的”基因进入细胞并增殖；携带大片段外源DNA分子，占总量25%时仍不失活(3)柯斯质粒(cosmid)结构：噬菌体cos＋质粒ori

既可以包装成噬菌体，又可以在细菌中大量复制。承载：～50kb克隆真核生物的基因、作图Ori－质粒复制原点，可以在细菌中扩增SV40Ori－噬菌体复制原点，可以在病毒中复制cos－噬菌体包装Neor－新潮霉素抗性基因Ampr－氨苄霉素抗性基因Ampr(4)穿梭质粒(shuttlevectors)定义：能在两种不同生物中复制的载体。一种：原核生物（E.coli）一种：真核生物（酵母）结构：

a.复制原点：oriE.coliARS（自主复制序列）

酵母

b.选择标记：两种宿主不同的标记。酵母：URA3（尿嘧啶合成基因）细菌：ampr、Tcr应用：在细菌中克隆、扩增基因在酵母中表达(5)细菌人工染色体(BAC)BAC载体一般可携带大于50kb的外源DNA片段。F因子改造成BAC载体，甚至可用于克隆100kb以上的DNA片段。特点：带有外源DNA的BAC载体在细胞中是单拷贝的载体分子量很小(7.4kb)选择标记：氯霉素抗性基因多克隆位点应用：克隆大型基因簇基因构建基因文库(6)酵母人工染色体(YAC)YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点特点：承载大（1000kb）嵌合率高插入片段不稳定生长慢，操纵难应用：适合高等生物大基因组的克隆、作图(7)Ti质粒Ti质粒是一种细菌质粒，存在于一种革兰氏阴性菌—根瘤土壤杆菌细胞中，可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤Ti质粒的一部分DNA叫做T-DNA，当T-DNA整合到宿主细胞的染色体后，就诱导出根瘤，使根瘤细胞合成冠瘿碱(opine)TI质粒特点1.具有五个主要功能区域：①.T-DNA：可整合到植物基因组②.质粒转移区(PT)③.冠瘿碱(opine)代谢区④.复制原点⑤.毒性区2.T-DNA中直接参与转移并整合的序列：T-DNA两端与其它序列交界处的25bp不完全直接重复，右端的这段序列称为右界(RB)，左端的序列称为左界(LB)。3.V区的毒性基因：T-DNA转移所必需，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。viroriopinecatabolismPTLBRBT-DNA(8)Ti质粒衍生载体双元载体(binaryvectors)：该系统具有两个质粒：①.用于克隆外源基因片段的克隆质粒：在E.coli和农杆菌中复制，容易操作，并可在二者间转移，是一种穿梭质粒；②.非致病质粒：具有毒性基因，没有T-DNA序列。将两个质粒分别导入进农杆菌中，经农杆菌介导，克隆质粒中的外源DNA转移到植物染色体中共整合载体(intergratedvectors)：

这个系统包括两个质粒，一个用作克隆外源基因，另一个具有毒性基因，但这两个质粒具有一段同源序列，在农杆菌中重组整合成一个载体。（一）基因的分离人工合成基因常规克隆的DNA片段从基因库中分离基因聚合酶链式反应（PCR)四、基因的分离及鉴定(1)从基因库中分离基因基因库(library)：是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。构建基因库核基因库染色体基因库cDNA库核基因库(genomiclibrary)：将某生物全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成。构建文库可采用不同的载体：质粒载体：重组质粒导入感受态细胞

收集菌落噬菌体或柯斯质粒(cosmid)载体：将重组DNA包装进噬菌体

感染细菌

收集噬菌斑BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体：重组人工染色体

导入宿主细胞

收集细胞理想的核基因库应当能包括全部的基因组序列染色体基因库：将基因组的一部分（例如一根染色体）用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体的结构和组织十分有价值如果蝇的多线染色体：对染色体进行微切割，可以构建染色体区段的基因文库cDNA库：以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA(complementaryDNA,cDNA)构建的基因库cDNA库与核DNA库不同：cDNA库仅具有细胞或组织内表达基因的mRNA序列仅包括基因组的部分基因序列筛选基因库根据待选基因相关信息，确定筛选方法和条件，从基因库中筛选、分离基因方法：菌落杂交、噬菌斑杂交、其它方法（如PCR法基因芯片等），杂交用的探针主要有DNA（荧光、放射性同位素标记）和蛋白质抗体噬菌斑杂交筛库过程：将噬菌体感染形成的噬菌斑印影在硝酸纤维膜上变性

带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交

放射性自显影

杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆阳性克隆的分析与鉴定：从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因(a).限制性酶图谱：构建阳性克隆的限制性酶图谱

根据同源性分析，了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置

用于进一步亚克隆或同已知的其它序列比较23kb9.4kb6.6kb4.4kb2.3kb2.0kb0.6kb15kb12.2kb2.8kb10.2kb4.8kb10.2kb2.8kb2.0kbSa1Not14.8kb7.4kb2.8kbSal1Not110.2kb2.0kb2.8kbⅠⅡAB限制性酶图的构建A.酶切DNA片段的凝胶电泳结果B.限制性酶图谱的两种排列模式。仅据Not1和Sal1分别酶切的结果，可有I和II两种排列方式。如果结合两种酶同时酶切的结果分析，模式II是正确的。(b)核酸分子杂交Southern杂交：DNA探针与DNA的杂交，检测某段特征DNA序列及其拷贝数Northern杂交：DNA探针与RNA的杂交，用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，检测mRNA的存在Western杂交：蛋白质与抗体的杂交，用于分级克隆的基因表达水平Southern杂交操作步骤检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同靶核酸：RNARNA电泳转膜：不需变性原理：

在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southernblot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测用途：

检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

Northernblotting

WesternBlotting一般流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色(c)核酸序列测定测定克隆后的DNA片段核酸序列：一般采用Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸终止法测定核酸序列。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种dNTP，并混入限量的一种不同的ddNTP，由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定，最后通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测在SANGER双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记（2）聚合酶链式反应(PCR)扩增基因(PolymeraseChainReaction)1983年Dr.KaryB.Mullis发展出现今的PCR技术，他因此获得了1993年诺贝尔化学奖。PCR反应体系模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTPs反应缓冲液辅助因子：Mg2+（Taq酶：嗜热杆菌中提取，72℃活性最高，94℃半衰期达到近半小时）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020耐热DNA聚合酶Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。PCR反应三个步聚(一个循环)：1.变性：90℃-96℃，双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA；2.复性：25℃-65℃，系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链；3.延伸：70℃-75℃，在引物的引导和Taq酶（在72℃左右最佳活性）作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端向3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍PCR引物设计原则长度在15-30bp，GC含量在45-55%之间。退火温度设置：

Ta(退火温度)=Tm-5℃*Tm（引物）=4(G+C)+2(A+T)

碱基分布表现出随机性，避免相同碱基连续排列。上下游引物间3’端不能与互补，以免形成引物二聚体。不能同目标序列发生错配。引物必须经GenBank查询后，证实没有与其他非目的

DNA有高度互补后才能使用PCR的类型1)常规PCR(regularPCR)

是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列2)反向PCR(reversePCR)已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶AAA(A)n5’-CapmRNA(dT)12~18

primer5’-CapAAA(A)n3’5’反转录dNTP,RT5’-CapAAA(A)n5’cDNA:mRNAhybrid常规PCR扩增3）RT-PCR(Reversetranscriptase-PCR)(3)人工合成基因根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可很快地人工合成基因SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)技术，可扩增出完整的基因序列。五、基因工程的应用基因工程工业植物基因工程转基因动物遗传疾病诊断基因治疗基因芯片（一）基因工程工业生产胰岛素、表皮生长因子、生长素、干扰素、基因工程疫苗等酵母菌、植物悬浮细胞、植株和动物培养细胞均可应用于表达外源蛋白

最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人的胰岛素(1982)（二）植物基因工程植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程许多植物基因已经被分离、克隆主要方法有：原生质介导法、基因枪介导法、农杆菌介导法、花粉管通道法等，其中以农杆菌转化法和基因枪转化法应用最多世界上第一种转基因作物，是一种含有抗生素药类抗体的烟草，1983年得以培植出来。

转基因番茄

1994年，美国政府批准并研制成功抗干旱、早熟、保鲜的转基因番茄随后商品化原生质体介导法

概念：以原生质体为受体，借助于特定的化学或物理手段将外源ＤＮＡ直接导入植物细胞的方法

主要方法:1)PEG介导的基因转化2)脂质体（liposome)介导的基因转化3)电激法4)激光导入法5)显微注射法基因枪法（微弹轰击法）工作原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因的转化动力类型：火药爆炸力；高压气体；高压放电

根癌杆菌介导法根癌农杆菌广泛浸染双子叶植物和裸子植物根据根癌农杆菌诱导植物形成的根瘤中冠瘿碱的不同可分为章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型3种类型。在根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒，简称Ti质粒，包括T-DNA区（LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组）、质粒转移区(PT)、冠瘿碱(opine)代谢区、复制原点(ori)和毒性区(vir)viroriopinecatabolismPTLBRBT-DNA步骤：载体构建：将目的基因与启动子（常见的花椰菜病毒35S）及终止子组成嵌合DNA分子，插入到Ti衍生质粒RB与LB内构成重组质粒工程菌制备：制备农杆菌感受态细胞，将重组质粒转入农杆菌细胞侵染：利用工程菌去感染植物细胞，使质粒部分DNA包括目的基因，整合到植物染色体筛选：包括抗性筛选，组织化学筛选等分子鉴定：获得抗性植株后，还需经过PCR、Southernblot、RT-PCR、Northernblot、Westernblot等分子手段进行鉴定农杆菌转化法花粉管通道法在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出（三）转基因动物转基因动物：目的基因+载体

重组DNA

微量注射法将重组DNA导入受体合子细胞核

遗传转化。如：利用转基因羊

大量表达人类的抗胰蛋白酶，可分泌人类生长因子Ⅸ的转基因羊“Polly”。(Wilmut等，Nature385,1997)（四）遗传疾病诊断利用重组DNA技术进行遗传疾病诊断，是直接从DNA即基因水平进行诊断

准确度高，速度快。如进行产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。（五）基因治疗特异基因导入并整合到有遗传缺陷患者基因组中

治疗遗传疾病，通常叫做基因治疗（genetherapy）。单基因遗传病：白化病、先天性聋哑、血友病等。多基因遗传病：唇裂、腭裂、精神分裂症、先天性心脏病。1.RFLP法原理：限制性内切酶能识别并切割特异核苷酸序列。某位点核苷酸序列发生突变

有可能导致缺失或产生新的限制性酶切位点。若突变只发生在同源染色体的一条上，另一条正常，限制性内切酶酶切

DNA片段带型可用于鉴别同源染色体的差异。酶切后产生的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多态性(restrictionfragment

lengthpolymorphisms，RFLP)。RFLP差异具有共显性特点。BamHI酶切位点镰刀性贫血病的诊断：该病由β－球蛋白基因一个核苷酸突变（由GAG变成GTG)导致的，这个核苷酸改变也正好导致一个限制性酶切位点改变。杂合体经酶切产生带型差异，识别该位点。2.等位基因特异寡核苷酸法即：allele-specificoligonucleotide，ASO当已知突变基因的核苷酸序列时，可用人工合成的寡核苷酸进行PCR反应，将PCR产物用作点杂交分析，鉴定基因型。这种用于检测单个核苷酸变异的方法，称为ASO法。许多遗传疾病可用该法诊断。（六）基因芯片(GeneChip,DNAChip)又称DNA微阵列(DNAMicorarray)，是指按照预定位置在固相载体（玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等）上很小面积内固定千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。在一定条件下，这些核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。特点：无可比拟的高效、快速和多参量。应用：基因克隆、基因表达分析、基因诊断等。DNA芯片技术在小面积(如2cm２)基片表面分成不同小格

有序点阵排列在一定位置、可寻址的核苷酸分子

将待分析核苷酸分子标记(如用荧光)，变性成单链与芯片上序列相同的核苷酸分子杂交

与芯片上序列不同的核酸分子被洗掉

利用高精度的激光扫描仪记录分子已杂交的荧光信号

计算机软件分析。1.DNA芯片 2.用标记的DNA与DNA芯片进行分子杂交3.检测杂交信号不同颜色表示不同的表达丰度DNA芯片的基片：玻璃、硅片或尼龙等。应用领域：基因多态性检测（如单核苷酸多态性筛选，singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)；基因表达分析（不同细胞和不同组织的RNA群体比较）；克隆选择及文库筛选（如cDNA文库）；基因突变检测及遗传病和肿瘤的诊断等。第二节基因组学基因组(genome)泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色体（单倍体）DNA。

一、基因组学概念及范畴基因组学(genomics)就是发展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序，分析生命体（包括人类）全部基因组结构及功能。基因组基因组大小一般是指生物单倍体细胞核基因组总DNA含量，以1C表示。另一种基因组大小的度量单位是质量单位，用C值表示，是指一个生物单倍体核基因组总DNA的质量，一般用pg(picogram，1pg=10-12g)表示，各物种都有特定的C值显花植物鸟类哺乳动物爬行动物两栖动物多骨鱼类软骨鱼类棘皮动物甲壳纲动物昆虫软体动物线虫类真菌类藻类细菌类支原体病毒质粒bp图.不同生物基因组的单倍体DNA含量一般讲，C值随生物的复杂性而增加，但有时复杂性较高的生物，C值反而较低，反之亦然。这种C值与生物复杂性不一致的现象(如两栖类与哺乳动物)称为C值悖理(C-valueparadox)2.基因组计划1990年美国启动被誉为“人体阿波罗计划”的“人类基因组计划”，投资30亿美元，计划历时15年

测定人类基因组的30亿个核苷酸对的排列次序

构建高分辨率的人类基因组遗传图谱和物理图谱

发展生物信息学，中国承担1%人类基因组计划测序工作。(1)人类基因组计划简史1986年美国杜伯克在《科学》上撰文，号召大家联合起来，从整体上把人类的基因组搞清。1990年10月经5年的辩论以后，美国国会终于批准被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划。1998年5月在美国罗克威尔组建私人公司：塞莱拉遗传公司，目标是投入3亿美元，到2001年绘制出完善的人体基因图谱，与国际人类基因组计划展开竞争。1999年12月1日国际人类基因组计划联合研究小组宣布，完整破译出人体第22对染色体的遗传密码。2000年5月8日，由德国和日本等国际科研小组宣布，基本完成了人体第21对染色体的测序工作。2000年6月26日，中、美、日、德、法、英等6国科学家公布人类基因组工作草图，标志着人类在解读自身“生命之书”的路上迈出了重要一步。2001年2月12日，6国科学家和美国塞莱拉公司联合公布人类基因组图谱及初步分析结果。2003年4月14日，6国科学家宣布人类基因组序列图绘制成功，HGP的所有目标全部实现。覆盖人类基因组所含基因区域的99%，精确率达到99.99%，比原计划提前两年多，耗资27亿美元。并公开研究数据和结果，赢得了这场竞赛。但国际HGP的协作组与私人公司的竞争仍没有停止过，目前在许多领域研究仍进行竞争，如在单个基因型的SNP图谱研究方面。(2)主要组成部分①构建基因组的遗传图谱；②构建基因组的物理图谱；③测定基因组DNA的全部列；④绘制基因组的转录本图谱；⑤分析基因组的功能。（3）测序的意义及其在基因组计划中的地位核苷酸序列决定RNA和蛋白质的氨基酸序列，进而决定蛋白质的结构和功能(蛋白组学)；DNA序列的改变能导致蛋白质丧失功能，对动植物产生有害影响；了解特殊的DNA序列，能探明人的遗传状态并为最终的治疗提供希望；DNA技术已延伸到环境、农业和法医等领域。1).测序的意义2)测序在基因组计划中的地位结构基因组学基因组计划比较基因组学BioinfBioinf应用BioinfBioinfBioinf开发新工具功能基因组学BioInf新工具的应用人类文明丰衣足食健康“长寿”微生物学有益微生物的利用和有害微生物的控制人类疾病放控、抗衰老法医学等动植物科学遗传改良、环境保护生物多样性、观赏表已完成测序的代表性基因组生物特点完成时间MS2噬菌体第一个RNA基因组1976PhageΦX174第一个DNA“基因组”1977Mycoplasmagenitalium(真细菌)已知自由生存生物中最小的基因组1995Haemophilusinfluenzae(真细菌)专性寄生物1995Methanococcusjannaschii甲烷球菌1996S.cerevisiae(Yeast)及另外4个真菌，真核生物！！！1996E.coli真细菌，模式生物1997Caenorhabditiselegans发育模式生物1998Drosophila发育模式生物2000Arabidopsisthaliana模式植物2000M.musculus小鼠人类疾病与发育过程的模式生物2002OryzasativaDraftsequence2005Anophelesgambiae疟蚊2002Humangenome2003二、基因组图谱的构建：（一）基因组中核苷酸顺序的测定方法：利用现有DNA测序方法，每个测序反应通常只能得到800个核苷酸的序列。小基因组物种常用鸟枪射击法。大基因组测序存在两个问题：片段数(n)庞大，片段间连接和装配非常复杂，重叠数为2n2–2n；基因组中相同或相似的重复序列在连接和装配时容易出错。解决方法：大规模序列测定前，构建基因组图谱可作为序列测定中制定测序方案的依据，以便锚定测知的核酸序列在染色体上的位置。鸟枪射击法序列测定及装配1.待测序的DNA片段2.测得的DNA序列3.两个片段之间重叠的序列测序方法：克隆连续序列法(clonecontig)：将基因组DNA切割成长度为0.1~1Mb的大片段

克隆到YAC或BAC载体上

分别测定单个克隆的序列

再装配连接成连续的DNA分子。定向鸟枪射击法(directedshotgun)：以基因组图谱中标记为依据

测序装配和构建不同DNA片段的序列。除性染色体外，根据构图方法和图距的度量单位，基因组中的每条染色体都可以有3种不同的遗传图谱：

连锁图谱

染色体图谱

物理图谱（二）遗传图谱分类连锁图谱(linkagemaps)：通过测算减数分裂时的重组率，揭示基因和其他DNA序列在基因组中各染色体上相对位置和距离的图谱，也称重组图谱(recombinationmaps)。物理图谱(physicalmaps)：通过DNA序列分析，揭示基因和其他序列在基因组中各染色体物理位置的图谱。染色体图谱(chromosomalmaps)：通过细胞遗传学方法，揭示基因或其它DNA序列在基因组中所在染色体、染色体臂和亚染色体区域的图谱。定义遗传图谱间的比较染色体图谱Chromosomalmaps

位点的染色体定位染色体臂定位染色体区域定位位点间相对顺序和大致距离位点顺序和距离的精确定位位点定位于DNA序列本身。连锁图谱Linkagemaps物理图谱Physicalmaps小鼠染色体17的3种图谱，染色体图和连锁图覆盖了整个染色体，连线连接了各位点在两个图中的相对位置。位点Tcp10b周围1200kb的长距离物理图与基因本身的短距离物理图。图染色体图谱、连锁图谱和物理图谱的比较（三）遗传图谱的构建1.图谱标记：可用基因或DNA作为可鉴别的标记(marker)。⑴.基因标记：基因控制性状的表现，利用可鉴别的形态、生化等表型性状作标记

根据连锁交换原理来分析基因之间的连锁关系和遗传距离

绘制连锁图谱。

缺点：基因数目有限、所构建遗传图谱不详细、标记间的遗传距离较大。⑵.DNA标记：每种生物DNA具有稳定性。依据对DNA多态性的检测手段，DNA标记可分为四大类：基于DNA-DNA杂交的DNA标记

该标记技术是利用限制性内切酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用经标记的特异DNA探针与之进行杂交，通过放射性自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。其中最具代表性的是发现最早和应用广泛的RFLP标记。基于PCR的DNA标记根据所用引物的特点，这类DNA标记可分为随机引物PCR标记和特异引物PCR标记。随机引物PCR标记过去主要有RAPD,近年来发展了一种新型标记：SRAP;特异引物PCR标记一般主要是指SSR标记。基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记

这类DNA标记可分为两种类型，一种是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制性片段长度的多态性，如AFLP；另一种是通过对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示被扩增区段的多态性，如CAPS。基于单核苷酸多态性的DNA标记

一般是由DNA序列中因单个碱基的变异而引起的遗传多态性，如SNP。几种分子标记的介绍（一）、RFLP

该技术由Grodzicker等于1974年创立。特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。RFLP包括以下基本步骤：（1）DNA提取；（2）用DNA限制性内切酶消化（3）凝胶电泳分离限制性片段（4）将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上（5）用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称Southern杂交）（6）放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性RFLP原理图产生多态性的原因是内切酶位点的变化。

原位点的消失；新位点的产生。GAATTCCTTAAGGATTTC

CTAAAG1212III5kb3kb2kb7kbRFLP标记的主要特点：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。由Williams等于1990年创立。其基本原理与PCR技术一致1、RAPD标记的引物

所用引物的核苷酸序列是随机的，长度通常为9-10个碱基，大约只有常规PCR引物长度的一半，使用短的PCR引物是为了提高揭示DNA多态性的能力。由于引物较短，所以在PCR中必须使用较低的退火温度，以保证引物能与模板DNA结合。设计的RAPD引物基本能覆盖整个基因组，并且已经商品化。（二）、RAPD标记2、RAPD的全过程（1）DNA提取；（2）DNA浓度、纯度和质量的估测：DNA产率一般为100-200ug/g鲜重组织，根据A260值可估测浓度而根据A260/A280（1.8）比值可估测纯度（1.0A260=50ug/ml1cm光程），DNA电泳也可大致检测其纯度；（3）PCR扩增（20ul体系）：A、94度预变性3分钟；B、94度变性30秒，37度复性30秒，72度延伸2分钟（40个循环）；C、72度延伸7分钟；D、4度保温；（4）电泳：1.5%琼脂糖凝胶电泳，80V电压1小时30分；（5）泡胶、成像、拍照RAPD原理图（1）将RAPD标记的特异带回收；（2）将此DNA片段连接到载体上；（3）对此DNA片段进行序列测定；（4）根据其碱基序列设计一对特异引物（18-24个碱基）；（5）以此特异引物对基因组DNA再进行PCR扩增，便可扩增得到与克隆片段同样大小的DNA片段。将RAPD标记转化为SCAR标记由Zabeau和Vos于1993年发明。AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。该技术结合了RFLP的稳定性和PCR技术的简便高效性，同时又能克服RFLP带型少、信息量小以及RAPD技术不稳定的缺点。

（三）、AFLP标记AFLP技术原理和操作步骤如下：（1）用限制性内切酶酶解基因组DNA，形成许多大小不等的随机限制性片段；（2）接着在这些片段的两端连接上特定的寡聚核苷酸接头（Oligonuleotideadapter）；（3）然后根据接头序列设计引物，由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3’端加入1-3个选择性碱基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合，成为模板被扩增，从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的；（4）最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将这些特异性的扩增产物分离开来。AFLP原理图AFLP标记的主要特点有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4）分辩率高，结果可靠；（5）用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。

由Moore等于1991年创立。SSR即微卫星DNA，是一类由几个（多为1-5个）碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重复。不同遗传材料重复次数的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性，即SSR标记。

（四）SSR1、卫星DNA—重复单元5~200BP，重复数可达105以上，

可形成10~15KB重复区。大部分分布于染色体着丝粒区

和端粒区。

2、微卫星DNA—重复单元1~4bp，重复区大多几十~几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具较高的多态性。常用检查方法：PCR等。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG微卫星DNAPCR扩增结果（示例）：500bp400bp300bp240bp这是一张人的SSR扩增电泳图该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种。微卫星DNA差异最小只相差2个碱基（重复片段只有2个碱基）。（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。

SSR标记的主要特点有：（五）SNP单个碱基多态性，分布于整个基因组，估计每500bp有个。第三代遗传标记。AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCTAATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCTAATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCTSNP流程图常用检查方法：DNA测序、芯片杂交等位点1位点2位点3芯片杂交结果示意图特点：密集。既可以进行连锁分析，也可以进行基因结构分析。（六）SSCPDNA分子在电泳中的行为取决于分子量和分子构象。DNA单链的构象取决于序列。PCR产物变形后于中性胶中电泳，与正常对照比较，若电泳行为异常，则认为内含突变的碱基。（七）SRAP（LI.G&QUIROS.C.F,THEORAPPLGENET,2001,103:455-461）

（1）

设计思想：EXONS富含GC且保守

INTRONS富含AT且个体间差异大

（2）引物设计：FORWARDPRIMER10BP+CCGG+3BP

REVERSEPRIMER10BP+AATT+3BP

EXAMPLEOFFORWARDPRIMERS:

ME1,5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′,

ME2,5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′,

EXAMPLEOFREVERSEPRIMERS:

EM1,5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′,

EM2,5′-GACTGCGTACGAATTTGC-3′,forwardprimers

5，－3，ME1TGAGTCCAAACCGGATAME2TGAGTCCAAACCGGAGCME3TGAGTCCAAACCGGAATME4TGAGTCCAAACCGGACCME5TGAGTCCAAACCGGAAGME6TGAGTCCTTTCCGGTAAME7TGAGTCCTTTCCGGTCCME8TGAGTCCTTTCCGGTGCME9TGAGTCCAAACCGGTAGME10TGAGTCCAAACCGGCATME11TGAGTCCAAACCGGTCTDC1TAAACAATGGCTACTCAAGPM8CTGGTGAATGCCGCTCTreverseprimers

3，－5，EM1GACTGCGTACGAATTAATEM2GACTGCGTACGAATTTGCEM3GACTGCGTACGAATTGACEM4GACTGCGTACGAATTTGAEM5GACTGCGTACGAATTAACEM6GACTGCGTACGAATTGCAEM7GACTGCGTACGAATTCAAEM8GACTGCGTACGAATTCTGEM9GACTGCGTACGAATTGATEM14GACTGCGTACGAATTCAGEM18GACTGCGTACGAATTCCTOD3CCAAAACCTAAAACCAGGASA4TTCTTCTTCCTGGACACAAAGA18GGCTTGAACGAGTGACTGA

SRAP

PRIMERS

SRAP电泳图2.连锁图谱的构建：⑴.人类基因组连锁图谱的构建：家系分析法：分析8个家系134个成员(186个减数分裂)

根据5264个STR(简单重复序列)标记绘制而成(X染色体分析是利用12家系170个成员(105个减数分裂)

将5264个标记定位在2335个位点

构建的人类基因组连锁图谱密度为每个标记599kb。⑵.植物基因组连锁图谱的构建：①.选择亲本：亲缘关系远，遗传差异性大，亲本间分子标记多态性强。②.产生构图群体：配制组合

建立分离群体：单交组合产生的F2；衍生的F3、F4家系；由连续多代自交或姐妹交产生的重组近交系(recombinantinbred

lines，RIL)；通过单倍体加倍而成的双单倍体(doubledhaploids，DH)；利用回交或三交(复交)产生的后代群体。③.遗传标记的染色体定位：

有单体、三体、代换系与附加系分析等方法，依据染色体剂量的差异

将遗传标记定位在特定染色体上。当供体材料总DNA等量时，DNA杂交带的信号强弱与该标记位于的染色体剂量成正比。④.标记间的连锁分析：

通过分析分离群体内双亲间有多态性的遗传标记的连锁交换情况和趋于协同分离的程度

即可确定标记间的连锁关系和遗传距离。目前已开发出许多构图软件，有些构图软件可以在网上获得，例如：MapMaker/Exp(/pub/mapmaker3/)：免费使用，可分析F2

和回交构图群体。GMendel(http://gnome/agrenv.mcgill/ca/info/gmendel.htm)：免费使用，可分析所有的构图群体，只要有共同标记，可将不同构图群体的图谱合并在一起。JoinMap(http://www.cpro.dlo.nl.cbw)：能分析所有构图群体，只要有共同标记，可将不同构图群体的图谱合并在一起。构图软件

3.物理图谱的构建（1）构建物理图谱的原因：

1.遗传图谱的分辩率有限：低等生物可重复进行多次杂交、测交

在短期内可产生大量群体、得到大量重组交换的子代群体

构建高密度的遗传图谱。人类或其它高等生物难以获得大量的子代群体，减数分裂的后代有限

限制连锁分析。

2.遗传图谱的精确性不高：染色体上有一些重组热点，其发生重组的频率高于其它位点

影响重组热点邻近区段的遗传图谱准确性。（2）构建物理图谱的三条途径：

1.限制性酶图谱：利用限制性内切酶绘制图谱，对于DNA分子长度小于50kb的片段，一般没有困难。而对于>50kb的DNA分子，可选用稀有切点内切酶酶切DNA。用识别位点较多核苷酸的内切酶：如Not

I，为8个核苷酸出现的频率为1/48=1/65536bp；而识别位点为6个核苷酸的出现频率为1/46=1/4094bp。选用其酶切位点在基因组中出现频率低的内切酶：人类基因组中，5’-CG-3’出现的频率很低：Sma

I

(5’-CCCGGG-3’)酶切DNA，每78kb有一个切点；BssH

II(5’-GCGCGC-3’)酶切DNA，每390kb有一个切点；Not

I(5’-GCGGCCGC-3’)酶切DNA，每10Mb只有一个酶切点。2.荧光原位杂交fluorescentinsituhybridization，FISH另一种物理图谱构建方法：荧光标记的探针与DNA分子杂交

染色体上杂交信号（即探针DNA在染色体上的图谱位点）在显微镜下可直接观察。步骤：取有丝分裂中期的细胞制片

将染色体变性成单链

将标记DNA探针变性后杂交到染色体上

观察分析。应用多色荧光原位杂交技术将10个BAC探针定位于水稻的第10号染色体的长臂上(引自Cheng等Genetics,2001)3.序列标签位点：已知序列为标签的位点（sequencetaggedsites，STS）作探针，与基因组DNA杂交

绘制物理图谱。STS的要求：为已知序列，便于PCR检测；基因组中仅此一个位点，无重复。常用的两大类型STS：①.特异DNA序列：表达的序列标签(expressedsequencetag，EST)，表达的序列来自cDNA。简单序列长度多态性(SSLP)也可用于物理图谱的构建，比较遗传图谱和物理图谱。DNA随机片段，测序后经分析比较，非重复序列可作为STS。②.DNA片段：辐射杂交系(radiationhybrid)：指啮齿动物细胞含有另一个生物染色体片段的细胞株。克隆的DNA片段序列利用YAC或BAC克隆的DNA，测序后可作为分子标记。不同克隆测定后，进一步分析克隆之间的重叠部分，将各克隆连接进来，可作为STS使用（3）人类基因组物理图谱人类基因组序列开始测定时，已有45万个EST，其中有一些重复序列

经计算机分析筛选后得到49625个，各代表一个基因

再从中筛选出3万个EST、二个辐射杂交系库（分别有83和93个细胞株）、一个有32000个克隆的YAC文库用于构建图谱。构建的物理图谱密度为每个标记183kb，EST分布结果表明基因在染色体上的排列是不均匀的。将上述遗传图谱及其它物理图谱整合

构成更加完整的人类基因组图谱，作为基因组序列测定的框架和分析依据。三、基因组图谱的应用基因组图谱中除了构建遗传图谱和物理图谱外，还可进一步根据标记类型细分为不同的称谓。如RFLP图谱、RAPD图谱、AFLP图谱等，目前已在拟南芥、番茄、水稻等30多种植物中构建了基因图谱。基因图谱的构建除了进行测序之外，还有许多用途。高密度水稻遗传连锁图（Harushima等，Genetics1998）：2275遗传标记，覆盖水稻基因组1521.6cM，标记间距离为：0.67cM。1.基因定位借助基因组图谱，可使基因定位在精度、深度、广度等方面有极大的提高。已陆续在一些农作物上定位了许多重要农艺性状和经济性状的基因，在复杂数量性状位点(quantitativetraitloci,QTL)定位分析方面，也取得了很大进展。F2(1252)F2S94XS06Self-pollinated6-7generationsF1F2S6-7Single-seeddescent重组自交系群体构建策略RIL群体单株

S94S06亲本多态性标记的筛选MS94S06RAPD标记

（1.5%Agarose）

S94S06SRAP标记

（4%PAGE）ME1EM2ME1EM3ME1SA4ME3EM5ME8EM5ME10EM5ME11EM4ME11EM9ME11EM14ME11EM8PM8EM1PM8EM5SCAR标记

（1.0%Agarose）S94S06

M多态性标记的群体分离分析SRAP标记

（4%PAGE）ME2GA2RAPD标记

（1.5%Agarose）OP-w15S_BE5-3SCAR标记

（1.0%Agarose）

LGNo.ofpointsLength(cM)Average(cM)

MolecularmarkerdistributionsonLGSRAPSSRSCARSTSMTM138130.83.4324110257157.22.8417900336129.93.6312300425103.64.1211300553191.73.6482300634191.75.6243403714100.97.293200total2571005.83.9206222513遗传连锁图谱基本参数LG1LG2LG3LG4LG5LG6LG7遗传连锁图谱全貌

黄瓜侧枝相关性状QTL分析黄瓜的侧枝性状S94S06黄瓜侧枝相关性状QTL分析

LG2LBALLBTLLBNFLBNSpringAutumn2seasonsLG7LG5LG1lbal1.319.0%(A);28.3%(S)lbtl1.326.2%(A);26.9%(S)

黄瓜果瘤基因Tu的精细定位果刺

刺座

果瘤果瘤的定义

果瘤是果皮着生果刺部位的瘤状突起

Groupseason(07)WartyfruitNon-wartyfruitTotalExpectedRatiox2F20652spring184632473:10.034BC1065206autumn58591171:10.009F206glspring72211203:10.290BC106gl06spring67591261:10.508RIL9406Sp/au1191052241:10.875F20592spring6413773:12.706F26106spring162532153:10.014F246110autumn179512303:10.980果瘤性状的遗传分析

果瘤性状呈单基因完全显性遗传分子标记分析

748SRAPmakers12outof748makersislinkedtoTugene

Tupooltupool**两个紧密连锁标记部分大群体电泳图SRAPM69SRAPM234F2分离群体F2分离群体F2分离群体P1P2P1P2F2分离群体WY遗传连锁分析与定位LocationofwartyfruitgeneTurelativetoSRAPmarkersandSCARmakerscs15ME6EM919.5Tu3.6u2.1Dss10.0LG6果瘤基因Tu的定位736SRAP240SSR15个标记9SRAP6SSR2.基因组比较分析已经在禾本科玉米、水稻、高粱、大麦、小麦和黑麦，茄科番茄、胡椒、马铃薯，十字花科拟南芥、甘蓝、花椰菜、油菜等进行遗传图谱比较分析，并从分子水平上了解物种间同源性，研究基因组的进化和染色体的演变。聚类分析图

:

黄瓜3.标记辅助选择标记辅助选择(marker-assistedselectionMAS)饱和基因组图谱可用来确定与任何一个目的基因紧密连锁的分子标记

根据图谱间接选择目的基因，可降低连锁累赘，加速目的基因的转移与利用，提高回交育种的效率。MAS育种不仅可以通过与目标基因紧密连锁的分子标记在早世代对目的性状进行选择，同时也可以利用分子标记对轮回亲本的背景进行选择。目标基因的标记筛选是进行MAS育种的基础。用于MAS育种的分子标记需具备3个条件：①分子标记与目标基因紧密连锁(最好lcM或更小，或共分离)；②标记适用性强，重复性好，而且能经济简便地检测大量个体(当前以PCR为基础)；③不同遗传背景选择有效。遗传背景的MAS则需要有某一亲本基因型的分子标记研究基础④有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件4.基因的克隆与分离根据饱和基因组图谱，可找到一个与目的基因紧密连锁的分子标记，作为染色体步行(chromosomewalking)起始点进行基因的克隆和分离，此法亦称图位克隆法(map-basedcloning)，为基因产物未知的基因克隆提供了捷径。染色体步行法黄瓜单性花基因M的精细定位与克隆黄瓜不同花类型

S52亲本（单性花植株，MM）植株分别着生雌花（left）和雄花（right）H34亲本（两性花植株，mm）植株仅着生两性花（center）ABM_mmM_mm

基因池（M_和mm）多态性标记的筛选与M基因连锁的SRAP标记的筛选167株F2群体SRAP标记初步定位利用BAC文库染色体步移5.种子种苗纯度检测技术

随机扩增多态性（RAPD）:

简单易行，但重复性不好，稳定性差扩增片段长度多态性（AFLP）

重复性好，分辨率高，但操作复杂，时间长，成本高简单重复序列（SSR），又称微卫星标记重复性好，需要有SSR引物序列，有些作物多态性差相关序列扩增多态性（SRAP）

简单，稳定，多态性好，产率高，对内含子和启动子区域扩增，便于克隆目标片段0652M10987654321500bp200bpSSRSRAPa)蔬菜作物的SSR和SRAP多态性引物的筛选b)蔬菜作物主栽品种的SSR和SRAP特异指纹筛选

筛选亲本和杂交种多态性引物(SSR和SRAP)

与其它同类品种比较差异，筛选特异指纹不同黄瓜品种的SRA