瓜子金皂苷己对氧糖剥夺复供诱导的pc12细胞凋亡的影响

瓜子金皂苷己对氧糖剥夺复供诱导的pc12细胞凋亡的影响

瓜子金配合素是从远志综合征中分离出来的一醇吨三醇单体。体内试验表明，它具有抗抑郁、镇静、焦虑和催眠的作用。最新报道PGSF对MPP+(1-methyl-4-phenylpyridinium)所致PC12细胞损伤具有保护作用,可通过促进大鼠海马齿状回突触传递发挥促智功能。提示PGSF可能具备广泛的神经保护作用。本研究旨在探讨PGSF对氧糖剥夺/复供(oxygen-glucosedeprivationandreperfusion,OGD/R)模拟缺血/再灌注损伤所致的PC12细胞凋亡有无保护作用,作用机制如何。1材料表面1.1表面活性剂和检测试剂PGSF由中国医学科学院药物研究所合成室提供,二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)溶解备用;AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天生物技术研究所);Bcl-2和Bax一抗(美国SantaCruz);ECL发光试剂(北京普利莱公司);DMEM培养基、胎牛血清、马血清(美国Gibco公司);Hochest33342、碘化丙啶(propidiumiodide,PI)、β-actin抗体(美国Sigma公司);PVDF膜(美国Millipore公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京Vigorous公司);连二亚硫酸钠(sodiumdithionite,Na2S2O4)及其他试剂为国产分析纯。1.2细胞植物1.3化学成分检测ThermoScientificMultiskanFC酶标仪(美国赛默飞世尔公司);BDFACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司);LAS-3000化学发光及影像分析仪(日本富士);RCM8000型荧光显微镜(日本Nikon)。2方法2.1体外氧糖剥夺法检测bmscsPC12细胞用含5%胎牛血清和5%马血清的DMEM培养基常规传代培养,在对数生长期以5×104个/孔接种于6孔培养板培养24h,用于分组处理。造模细胞用含10mmol·L-1Na2S2O4的无糖Earle’s液孵育4h作为氧糖剥夺处理,然后换为完全培养基继续培养24h作为复氧复糖处理。实验分组:正常对照组、OGD/R模型组、OGD/R+PGSF(10.00、1.00、0.10μmol·L-1)组。给药组在氧糖剥夺过程的Earle’s液和复氧复糖过程的完全培养基中都加入相应药物。2.2荧光显微镜测定造模及给药后,PC12细胞用4%多聚甲醛溶液固定,加入终浓度各为10μmol·L-1的Hoechst33342和PI,避光染色20min,PBS漂洗两次,在荧光显微镜下观察拍照并计数。2.3流式细胞术检测细胞系统中样品经OGD/R处理后,收集细胞培养液,用胰酶消化并吹下贴壁细胞,合并细胞悬液,2000r·min-1离心5min,弃上清,按试剂盒说明书进行AnnexinV和PI染色,随即上机进行流式细胞仪检测,每个样品计数10000个细胞。AnnexinV-FITC染色阳性为绿色荧光,PI染色阳性为红色荧光。2.4荧光显微镜照片(mitochondrialmembranepotential,MMP)造模结束后,用PBS漂洗细胞1次,然后加入PBS溶解的10μmol·L-1JC-1,37℃、5%CO2培养箱负载20min,PBS漂洗后于荧光显微镜下拍照。2.5细胞裂解蛋白定量的测定造模及药物处理结束后,弃上清,收集细胞,4℃,2500r·min-1离心5min,取沉淀,经PBS漂洗后,加入细胞裂解缓冲液100μl,冰浴30min,收集细胞裂解液,12000r·min-1离心30min,取上清用BSA法进行蛋白定量。每组取蛋白样品10μg上样,经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜上,3%BSA室温封闭2h,加一抗于4℃孵育过夜,TBST洗膜后,加相应二抗室温孵育2h,ECL显色,化学发光仪成像。实验重复3次。2.6组间比较分析实验数据以ue0af±s表示,以SPSS12.0统计软件分析。组间比较用单因素方差分析(one-wayANOVA)。用Gel-Pro3.2软件对Westernblot实验条带进行灰度扫描和分析。3结果3.1晚期凋亡或死细胞被破坏的细胞正常对照组细胞核被Hoechst33342着染后呈均匀蓝色荧光;凋亡细胞核因染色质凝聚呈现不均匀强蓝色荧光,或因核碎裂出现凋亡小体;晚期凋亡或坏死细胞因为细胞膜被破坏,细胞核被PI着染而呈强红色荧光。OGD/R组红色荧光细胞较正常组明显增多,说明大量细胞死亡;PGSF各剂量组红色荧光细胞都明显少于模型组,染色质凝聚及细胞核碎裂现象减少,表明PGSF可明显减少OGD/R处理细胞的晚期凋亡或坏死数量。见Fig1及Tab1。3.2减少细胞凋亡/死率流式细胞术检测结果显示,PGSF主要影响细胞晚期凋亡/坏死百分率。OGD/R处理使细胞晚期凋亡/坏死率由正常对照组的4.04%增至28.24%,PGSF10.00、1.00、0.10μmol·L-1可分别使细胞晚期凋亡/坏死率降低至10.07%、10.42%、16.74%。再次验证了PGSF对OGD/R处理PC12细胞具有保护作用,且其作用具有浓度依赖性。3.3pgsf-pbd/r检测细胞线虫膜电位,将火炬放空在体内表达,结果显示:正常组细胞被激发后多数呈红色荧光,线粒体膜电位正常,呈绿色荧光细胞仅占(4.6±0.1)%;OGD/R处理可使(82.8±3.1)%的细胞呈绿色荧光,说明多数细胞线粒体膜电位降低,与正常组差异具有显著性(P<0.01)。PGSF10.00、1.00、0.10μmol·L-1组呈绿色荧光细胞分别占(17.7±1.4)%、(24.4±3.4)%和(59.3±5.6)%,与OGD/R组比较明显减少(P<0.01,P<0.01,P<0.05),说明PGSF可浓度依赖性地抑制OGD/R引起的线粒体膜电位的降低。见Fig2。3.4细胞凋亡相关蛋白由Fig3可见,与正常对照组相比,OGD/R可使PC12细胞凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值明显降低;PGSF10.00、1.00、0.10μmol·L-1分别使Bcl-2/Bax比值回升至模型组的2.6倍、2.4倍和2.3倍。4pgsf调控caspase-1的机制脑缺血后尽快恢复血流是防治缺血损伤的最有效措施,然而再灌注损伤会使脑功能出现更加严重的障碍。在缺血性脑损伤中神经细胞表现出坏死和凋亡两种死亡形式,抑制神经细胞凋亡的发生是治疗缺血性脑血管病的重要着眼点。PC12细胞是大鼠嗜铬细胞瘤细胞,具有很多神经细胞的特性,常代替神经细胞用于研究。Na2S2O4为氧清除剂,起效迅速且不损伤细胞膜。Na2S2O4合并低糖常被用来构建简单安全的的低氧低糖模型以用于实验研究。本课题以此模型为基础模拟脑缺血/再灌注损伤,从多个角度证明了PGSF对OGD/R处理的PC12细胞具有明显的保护作用。目前尚未见到其它关于PGSF对缺血/再灌损伤的作用方面的研究报道。线粒体是细胞的产能供能中心,正常的MMP是维持线粒体功能所必需的。MMP下降是细胞凋亡过程中的早期事件,是凋亡的特异性改变。OGD/R等因素可使线粒体内外膜交界处存在的线粒体通透性转换孔以高通透构象持续性开放,膜间隙正离子不断进入基质,致使内膜两侧电势差减少,MMP下降或消失,线粒体肿胀,功能受损,细胞色素C等凋亡相关分子释放到胞质,最终激活Caspase家族成员介导的细胞凋亡。JC-1能渗透到细胞器内并与线粒体特异性结合,目前作为检测MMP最好的荧光染料而被广泛应用。在MMP较低时,JC-1以单体存在于胞质,MMP较高时,JC-1形成聚合物聚集在线粒体基质中,被激发后分别产生绿色和红色荧光。在荧光显微镜下观察细胞颜色即可判断MMP的变化。Bcl-2家族成员在细胞凋亡的调控过程中发挥重要作用,并与MMP的改变存在密切关系。文献报道,抗凋亡蛋白Bcl-2可能通过保持线粒体内、外膜的完整性以及增加线粒体基质内质子的外流而抑制MMP的下降,还可通过与caspase-9等形成复合物而抑制caspase-3的激活。相反,促凋亡蛋白Bax等可转位至线粒体而促进线粒体通透性转换孔开放,诱导凋亡。最终,Bcl-2和Bax通过影响细胞色素C的释放而抑制或促进细胞凋亡。Bcl-2还可与Bax形成异源二聚体,抑制Bax的促凋亡效应,Bcl-2和Bax二者的比例对