鸡堆型艾美耳球虫的分离鉴定

鸡堆型艾美耳球虫的分离鉴定

鸡球虫是影响鸡场健康发展的最重要寄生虫。蠕虫是1929年饲养鸡场最常见的昆虫之一，分布广泛。为对堆型艾美耳球虫的生物学特性有进一步的了解,我们从长春市区某鸡场采集的混合感染球虫样品中,分离获得了堆型艾美耳球虫纯种,并对其致病性进行了观察,建立的纯种毒株既为药物的疗效试验和免疫研究中的提供攻毒虫体,也为球虫致弱苗研究提供原代种虫。本文就来自长春市堆型艾美耳球虫纯种的分离鉴定和致病性观察情况进行报道。1材料和方法1.1球卵囊的分离培养从长春市某鸡场死于球虫病的鸡肠道内容物中,按常规方法分离出球虫卵囊,加入2.5%重铬酸钾溶液置于29℃恒温培养箱中,培养至孢子化,获得混合球虫卵囊。1.2试验动物海兰公鸡,购自长春市农业科学院。出壳后运回实验室,饲养在经火焰消毒的笼具中。饲料、饮水、食槽等用具均高温消毒。1.3引物、培养、分离取混合种卵囊液离心洗净重铬酸钾,计数,按每只鸡1个孢子化卵囊经口接种于10日龄雏鸡,接种后7d剖杀鸡,取十二指肠和小肠前段内容物,分离卵囊,培养至孢子化备用。1.4个卵囊的确定和喂给参照黄兵等报道方法,制备1%的琼脂,溶解后浇在载玻片上,厚约1.5mm。用牙签沾取初次分离卵囊稀释液轻轻涂在琼脂块表面,在10×10倍镜下确定为单个卵囊时,后用自制的安装在显微镜上的打孔器切割琼脂,用细针头将切割的小块琼脂移置另一载玻片上,再次用10×40镜检确定单个卵囊后,经口喂给2日龄无球虫雏鸡,并滴入1-3滴蒸馏水,促其吞咽。感染后5d逐只查粪便,发现卵囊即为单卵囊后代,分离培养至孢子化。1.5肠道生殖发育特点对单卵囊繁殖的后代,接种无球虫雏鸡进行增殖,并根据其在肠道寄生部位、肉眼病变、潜伏期(卵囊最早排出时间),卵囊最短孢子化发育时间。卵囊和孢子囊的大小、形状、结构等指标。对照国内外文献,确定虫种,进行繁殖。1.6组堆型艾美尔球虫子化卵囊感染后1周后情况比较选择2周龄无球虫感染、体重相近的海兰公鸡50只,随机分成5组,即1个不感染组和4个感染组。除不感染组外,其余4组,每只口服感染1×104,2×104,5×104和10×104个堆型艾美尔球虫孢子化卵囊。感染后1周结束试验,以平均增重、死亡率、病变记分作为试验指标,并对各组增重进行统计学比较。肠道病变记分参照Johnson和Reid(1970)标准。2结果2.1感染鸡卵囊的鉴定分离获得的球虫主要寄生在十二指肠和小肠前段,致病力中等,引起肠壁增厚。严重感染时亦扩展到小肠,从十二指肠到小肠前段浆膜面可见到成片多量灰白色横纹状白斑,外观呈现阶梯状,肠黏膜面和浆膜面有大量的出血点。肠内含有大量粘稠的分泌物。取肠内容物和肠黏膜刮取物镜检,卵囊为卵圆形,卵囊壁光滑,呈淡绿黄色,囊壁分二层,厚约1.01μm。卵囊窄端内壁变薄,形成极孔,1个折光性强的极粒在其附近,少数2个,无卵囊残体。测200个卵囊的平均大小为(13.5-21)×(11-17.5)μm,平均为17.5×14.5μm,形态指数为1.21。测200个孢子囊大小为(4.6-9.5)×(3.5-6.5)μm,孢子囊有斯氏体,无残体。用此卵囊人工感染雏鸡,在感染后97h粪中查到少量卵囊,此卵囊在2.5%重铬酸钾溶液中,置于29℃恒温培养18h,见到孢子化完全的卵囊,并感染雏鸡获得成功。根据上述结果,对照国内外文献,确定该种为堆型艾美耳球虫(EimeriaacervulinaTyzzer1929)。2.2疾病观察2.2.1鸡的一般情况感染初期,各组试验鸡精神、饮食欲无明显的异常。感染后84h,接种堆型艾美耳球虫卵囊5×104和10×104两组鸡表现为饮食欲减少,羽毛逆立,粪便变稀,其它组试验鸡无明显症状;感染后144h,感染各组均出现明显的临床症状,粪便开始变稀不成形,带有大量粘液,部分试验鸡粪便带血。除感染10×104组鸡死亡2只外,整个试验其它各组鸡未发生死亡。2.2.2组患者各感染组间比较试验各感染组鸡在感染后7d内的平均增重量不一,试验各感染组的平均增重都不同程度地低于对照组。统计结果表明,1×104、2×104组与对照组之间差异显著(P<0.05),5×104和10×104组与对照组之间差异极显著(P<0.01)。各感染组间相比,1×104、2×104组与5×104和10×104组之间差异显著(P<0.05)。由此可见堆型艾美耳球虫对增重影响比较明显,随着感染剂量的增加,增重明显减少。2.2.3肠道病变的程度试验各组感染鸡,病理剖检均观察到不同程度的肠道病变,随着感染剂量的增加,病灶数量也相对增多,十二指肠和小肠前段肿胀,粘膜明显增厚。病变记分结果见表1。3种球虫属e.常见艾美耳球虫3.1堆型艾美耳球虫(E.acervulina)显著的特征是寄生在十二指肠和小肠前段,严重感染时浆膜面可见到成片多量灰白色横纹状白斑,外观呈现阶梯状。我们分离获得的这株球虫具有此特征,其卵囊结构、测得的卵囊和孢子囊大小、卵囊形状指数、潜隐期和孢子发育最早时间均在文献记录的范围。因此,可鉴定这株纯种球虫为堆型艾美耳球虫(EimeriaacervulinaTyzzer1929)。3.2堆型艾美耳球虫(E.acervulina)的致病性在不同地方株之间有明显差异。本次分离获得的纯种堆型艾美耳球虫,是鸡场最常见的球虫种类之一,有一定的致