融合蛋白柔性linker的选择

融合蛋白柔性linｋer的选择————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期:蛋白融合Linkeｒ的设计与选择接头序列(Linkｅr)设计是基因融合技术能否成功的核心技术之一。即通过一段适宜的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来,使其在适宜的生物体内体现成为一条单一的肽链,其中起连接作用的氨基酸称为Lｉｎｋeｒ[1］。融合蛋白中的两种成分能否分别形成对的的空间构造、更加好的发挥生物学活性,与连接融合蛋白中两种成分的接头序列亲密有关。重组生成的融合蛋白规定插入融合蛋白中的ｌinｋeｒ不能影响目的蛋白各自的功效。因此，Liｎkｅr序列的设计和选择对融合基因的构建至关重要。针对Lｉnker序列的设计和选择己有诸多有关的研究[2]。现在的研究重要有两种,即螺旋形式的Lｉnker肽如［Ａ(EAAＡK)nA]和低疏水性、低电荷效应的氨基酸构成的接头,后来者应用较广泛。这种低疏水性、低电荷效应的氨基酸构成的多肽接头能够充足伸展以分开两种融合的组分,使之能在互不干扰的状况下充足折叠成各自的天然构象。Ryｏiｃhi等[3］在两种不同功效的融合蛋白之间插入了不同类型的linkｅｒ序列,涉及可形成螺旋状的不同长度的肽链、柔性liｎkｅr以及葡萄糖球菌蛋白A(PA)。成果发现螺旋状的ｌinker同柔性linｋeｒ及ＰA同样，能够有效的将融合蛋白的两个构造域分开,甚至可增强融合蛋白的功效。Linkeｒ的长度是融合基因构建的又一种重要的因素。如果Linkeｒ的长度过长，则使融合蛋白对蛋白酶比较敏感,造成活性融合蛋白在生产过程中的产量下降;应用较短的Ｌiｎker,能够克服重组蛋白酶分解的问题,但可使两个融合分子相距太近造成蛋白功效的丧失。Lｉnker的长度不应不大于３.5ｎm,这是由于相邻肽键的距离为0.３8nｍ,因此连接肽最少应包含10个氨基酸。现在最为惯用的是Hｕstｏn设计合成的（GGGGS)3序列。研究发现,连接肽为（Gly4Ser）３的融合蛋白体现出较高的复性效率。这可能是(Gly4Ser)3连接肽较长且柔软,在复性时能够减少融合蛋白的两组份间的空间位阻,从而更有助于融合蛋白各个构造域的对的折叠。因此,Linkｅr的长度不能过长也不能过短。Linkｅr的选择,还应考虑Linkｅr内部的氨基酸序列,研究发现,Linkｅｒ构成相似但序列不同时,构建的融合蛋白的稳定性存在明显差别;编码Ｌinkeｒ的核苷酸构成,调节编码Lｉｎｋｅr的核苷酸构成,虽不变化原接头Ｌinker的氨基酸序列,但融合蛋白的体现存在明显差别。Ｌiｎｋｅr序列中有太多的α螺旋和β角构造会限制融合蛋白的伸缩性,进而影响融合蛋白的生物学活性。总之,Lｉnker的选择不是一成不变的,而要根据融合蛋白分子的大小和特性来决定。细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一大类多功效、高活性的生物物质。它在介导机体多个免疫反映及对各类免疫活性细胞的分化、发育和活化中起着十分重要的作用。细胞因子融合蛋白（cyｔokinefusｉｏｎprotein)技术是当今免疫学研究的一种热点方向。该办法是基于这些细胞因子含有相似或有关的功效活性而各自作用靶点不同,运用基因工程技术将两种或多个细胞因子融合在一起,其融合基因体现产物既含有其构成因子独特的生物学活性或使其某些活性明显提高,还可能会通过生物学活性的互补及协同效应发挥出较单一细胞因子简朴配伍所不含有的复合生物学功效,甚至还可能会产生某些新的构造及生物学功效，这种新型的人工蛋白含有极高的应用价值和良好的发展前景。早在１986年Ｓeno等用含ＥｃoＲI的12个核苷酸（４肽)CCGGAＡTＴCＡTG为接头,将IＦNγ和IＬ2片段加以连接,成果发现产生的融合蛋白含有ＩFNγ与ＩＬ２的双重活性。迄今为止,国内外已相继报道了多个有价值的细胞因子融合蛋白。现就细胞因子融合蛋白技术的原则、构建类型、应用现状以及发展前景做一简要概述。1细胞因子蛋白融合技术1.1蛋白融合的构建原则基因工程构建细胞因子融合蛋白须满足下列几个条件:(1)各融合分子的目的DＮA片段置于同一套调控序列(涉及启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)的控制之下。(2）融合分子间须以富含疏水性氨基酸的接头Linｋｅｒ连接,同时也要考虑接头序列的长度和核苷酸、氨基酸的构成、排列次序等因素。如融合蛋白内部接头的不同,可造成融合蛋白各部分化学构造的变化,而影响到各融合分子的空间构象，造成其生物学活性差别。因此,设计肽链之间的接头时，要尽量不影响两端蛋白的HYPERLＩNK""自然折叠，使各融合成分互不干扰。（３)为了确保融合蛋白的生物学活性,还需考虑构成融合蛋白各成分本身的特性及其互相作用机制。如肿瘤坏死因子(TNF）和α干扰素(ＩFNα)在克制肿瘤细胞、增强抗病毒活性等方面有协同作用。有学者构建了TNF和IFNα的融合蛋白,但发现该融合蛋白的抗病毒和抗肿瘤活性与单独应用TＮF和ＩFNα相比,抗病毒活性减少24倍,抗肿瘤活性减少15倍，与构建融合蛋白的初衷相背。分析因素，可能是这两种细胞因子的理化性质差别较大,IＦNα活性稳定,而TNＦ活性极易丧失,其融合蛋白在一定程度上影响了彼此的活性。1．2蛋白融合Liｎｋeｒ的设计与选择接头序列（Lｉnker）设计是基因融合技术能否成功的核心技术之一。即通过一段适宜的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来，使其在适宜的生物体内体现成为一条单一的肽链,其中起连接作用的氨基酸称为Ｌiｎｋer[1]。融合蛋白中的两种成分能否分别形成对的的空间构造、更加好的发挥生物学活性,与连接融合蛋白中两种成分的接头序列亲密有关。重组生成的融合蛋白规定插入融合蛋白中的linｋｅｒ不能影响目的蛋白各自的功效。因此,Liｎkｅr序列的设计和选择对融合基因的构建至关重要。针对Lｉnkeｒ序列的设计和选择己有诸多有关的研究[２]。现在的研究重要有两种,即螺旋形式的Ｌｉnker肽如［A(EAAＡＫ)nＡ]和低疏水性、低电荷效应的氨基酸构成的接头,后来者应用较广泛。这种低疏水性、低电荷效应的氨基酸构成的多肽接头能够充足伸展以分开两种融合的组分，使之能在互不干扰的状况下充足折叠成各自的天然构象。Ryoichi等［３]在两种不同功效的融合蛋白之间插入了不同类型的linker序列,涉及可形成螺旋状的不同长度的肽链、柔性ｌiｎkｅr以及葡萄糖球菌蛋白Ａ(PA)。成果发现螺旋状的linker同柔性ｌｉnｋer及PＡ同样,能够有效的将融合蛋白的两个构造域分开,甚至可增强融合蛋白的功效。Ｌiｎker的长度是融合基因构建的又一种重要的因素。如果Linkｅｒ的长度过长,则使融合蛋白对蛋白酶比较敏感,造成活性融合蛋白在生产过程中的产量下降;应用较短的Ｌinkｅｒ,能够克服重组蛋白酶分解的问题,但可使两个融合分子相距太近造成蛋白功效的丧失。Linｋｅr的长度不应不大于3．５nm,这是由于相邻肽键的距离为０.３8nm,因此连接肽最少应包含１0个氨基酸。现在最为惯用的是Huｓton设计合成的(GGＧGS)3序列。研究发现,连接肽为（Glｙ４Sｅr)３的融合蛋白体现出较高的复性效率。这可能是(Glｙ4Seｒ）3连接肽较长且柔软，在复性时能够减少融合蛋白的两组份间的空间位阻,从而更有助于融合蛋白各个构造域的对的折叠。因此，Lｉnker的长度不能过长也不能过短。Linker的选择,还应考虑Linker内部的氨基酸序列,研究发现,Linkｅr构成相似但序列不同时,构建的融合蛋白的稳定性存在明显差别;编码Linker的核苷酸构成,调节编码Linｋeｒ的核苷酸构成,虽不变化原接头Linkｅr的氨基酸序列,但融合蛋白的体现存在明显差别。Ｌｉnｋer序列中有太多的α螺旋和β角构造会限制融合蛋白的伸缩性,进而影响融合蛋白的生物学活性。总之,Ｌinker的选择不是一成不变的,而要根据融合蛋白分子的大小和特性来决定。2细胞因子融合方式及其应用根据细胞因子融合分子的不同,可把细胞因子融合蛋白大致分成下列几类:２．１不同或相似细胞因子的融合蛋白细胞因子含有多功效性和通用性,其作用的靶点各有不同。运用细胞因子的这一特点,能够通过基因融合技术创制出更佳的细胞因子融合蛋白,其融合基因体现产物很可能体现出双因子简朴配伍所没有的复合功效，并且有可能会增强各个组份间的协同作用。IL3和GMCSF均为造血刺激因子,它们对不同发育阶段的造血干细胞及祖细胞均含有促增殖和分化的作用,且共用受体β链。鉴于两者功效互补,Curtis等于1991年构建并报道了第一种由不同细胞因子构成的融合蛋白人ＧMCＳF/IＬ3和IL3／GMCＳF融合蛋白,分别称为PｌＸY321和ＰIＸY344。为确保其各自的天然构象，在ＧMＣSＦ与ＩL３两者之间均引入了一段疏水氨基酸序列,从而确保其与受体的结合。体外受体结合实验证明，PIXY3２１与只体现IL3受体的ＪM1细胞株或只体现GMCSＦ的HL6０细胞株结合时其亲和力比单体略高,阐明该融合蛋白可经IL3、ＧMCSF构造域与其各自的受体结合。同时,PIＸＹ3２1对AML1９3细胞株的增殖作用及刺激骨髓集落的形成都明显高于单独使用IL3、GＭCSF或IL３加GMCSＦ的作用,其作用可提高5~10倍。IL２、IL６是两个含有多个免疫调节活性的细胞因子。19９2年Ferｎａd等构建了两个人IL2／IＬ6融合基因,目的在于构建体现一种含有双重功效的免疫调节因子,实验表明融合蛋白与野生型ＩL2的活性一致，较IＬ6活性中度下降。出现此成果的因素可能是由于局部构象的变化或者是IL2与ＩL6之间的互相作用干扰所致。体外进一步研究表明，该融合蛋白既可诱导Ｔ、B细胞体现IL2R和ＩＬ６Ｒ,并且还可作为分子桥梁增进和稳定Ｔ、Ｂ细胞间的互相作用。国内的赵春华等也构建和高效体现了含有增进细胞集落形成、增进LＡＫ的增殖作用的IL２/IL6融合蛋白。将两种相似的细胞因子融合在一起也能够起到明显的生物学功效。马大龙等构建了人双体IL6、双体IL3融合蛋白，研究表明双体IＬ６与单体IL6在生物学活性上差别不大,但双体IL3对人骨髓细胞的集落刺激作用明显高于单体IL3的作用。ＩL7是T、Ｂ淋巴细胞成熟分化过程中重要的细胞因子,能够增强成熟T细胞的增殖及其功效,并有增进CTL增殖、分化并加强其杀伤活性,刺激LAK细胞活性的能力。Lai等[4]用一段柔性接头将IL7和人肝细胞生长因子β片段(ｈepaｔｏｃyｔｅgrowthfactｏｒbeta2chaｉn，HGFbeta）连接,成果发现融合蛋白能选择性的高效刺激B祖细胞系的增殖。胰岛素样生长因子(IＧF）常与其它生长因子一起发挥协同作用,是最佳的二联细胞因子融合蛋白的备选因子。IGFＩＩ可刺激多个组织中细胞的增殖或分化。将IGFII与一段信号肽以及胰岛素样的昆虫激素boｍyxｉｎ的N端序列融合体现,便可得到分泌形式的含有生物活性的BＯMIGF。Ｄifalｃo等制备了一种ＢOＭIGF和IＬ３的融合蛋白，体外实验中它可刺激正常外周血细胞中的骨髓干细胞集落形成,体内实验成果亦显示该融合蛋白能动员含有高度增殖活性的骨髓干细胞进人外周血，进而定居至脾脏而发挥造血功效。2.2细胞因子与其受体的融合蛋白细胞因子与其受体结合时,可增进其与其它有关分子的结合,进而提高其生物学活性的发挥。IL6在肝细胞的增殖中起着增强作用。IＬ６和ＩL6Ra(ｇp80)的结合使其易于和另一种受体IL６Rβ（ｇp１3０)结合。可溶性IＬ６R蛋白(sIＬ６R）与IL6结合后,靶细胞对IＬ６的敏感性增高,并可使仅体现膜结合型IＬ６R的细胞(IL６Rа/gp1３0）对IL６起反映。在sＩL6Ｒ/IL6双基因转染的小鼠中,sIL6R发挥锚定IL6的作用,延长血浆ＩＬ6半衰期,同时细胞对IＬ6的敏感性明显提高。Bcl2蛋白家族是细胞程序性死亡的重要调节因子,BclXＬ是Bcl２蛋白家族中的重要组员之一,它能在多个类型的细胞上克制由多个刺激所诱发的细胞死亡。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCＳF)含有刺激粒细胞和巨噬细胞集落增加的能力,其功效的发挥依赖于它与GMCSＦ特异性受体的结合。Ａntｏnelｌa等［5]将人GMCSＦ与ＢclＸＬ蛋白融合,该融合蛋白可与人单核细胞／巨噬细胞和骨髓祖细胞的上的GMCSＦ受体结合诱导其增殖,并使ＢclXL进入细胞克制细胞的死亡,加速细胞的增殖。2．3细胞因子与抗原融合蛋白某些细胞因子能够招募抗原提呈细胞(AＰC）,增进APＣ的成熟和信号转导，调节T细胞的功效，从而提高机体对抗原的免疫应答。因此,人们通过基因融合技术,将细胞因子与抗原融合，使其更加好的发挥基因佐剂作用。肿瘤细胞体现的免疫球蛋白(独特型,Id）能够作为肿瘤特异性抗原,在Ｂ细胞淋巴瘤中已证明用免疫球蛋白的可变区（即独特型)免疫动物,可保护动物免受随即的肿瘤攻击。Taｏ等从B淋巴瘤细胞(38C13）分离出Ｉd,将其与GMＣＳＦ基因融合,构建了Ｉｄ与GMCSF融合蛋白，Id的免疫原性明显增强,可诱导出含有抗肿瘤作用的特异性抗Id抗体。随即Chen等又构建了ＩdIL２和IｄIL4两种融合蛋白,均含有比较高的免疫原性。用IdIL２融合蛋白进行免疫可产生高滴度的抗独特型抗体IgG2a和lｇＧ3,而IdIL４和IｄGMCSＦ融合蛋白则无此作用。这3种融合蛋白都能诱导抗独特型抗体的产生，且不需要载体蛋白和佐剂。杨登科等[６]构建了结核分枝杆菌的Ag８５B和IL2嵌合基因疫苗,研究发现该融合蛋白含有Ag85B和IL2的双重功效活性,两者融合后产生协同作用,在体外增进了外周血单核细胞的增殖和Ｔｈ1型细胞因子的分泌。Hｉｔoｋi等[7]构建了IL1２和鼠疫耶尔森菌Ｆ1V融合蛋白(IＬ12/F1V,荚膜蛋白抗原(F１Ag）,毒力抗原(VAｇ))共体现基因疫苗,研究发现,用肺鼠疫攻毒后,ＩＬ12(低体现）/Ｆ1V相比IL１2(低体现)/F1、IL12(低体现)／V和ＩＬ12(低体现)/载体(vecｔor）DＮA疫苗而言,80%的小鼠获得保护。Ｍark等[8]构建了豚鼠髓脂质碱性蛋白(guｉｎｅapigmyelｉnbａｓicproｔeiｎ,GPＭBP;neｕrｏantiｇeｎorNAg)的重要致脑炎肽和白细胞介素16（ＩL１６)融合蛋白,研究发现该融合蛋白是路易鼠实验性本身免疫性脑脊髓炎的有效克制剂并证明IL16是研制致耐受性疫苗的最佳候选细胞因子。细胞因子与抗原融合产生的佐剂效应,可能比游离的细胞因子产生的佐剂效应含有更多的优点。因而,在疫苗研究中,细胞因子作为免疫佐剂越来越受到人们的重视。2.4细胞因子与抗体融合蛋白将抗体分子的片段与细胞因子融合，该融合蛋白不仅结合了抗体与抗原特异性结合的特性,还含有细胞因子的多功效活性,从而可借助抗体将细胞因子导向到特定的靶部位,使其高效发挥生物学功效，减轻全身毒副作用。IL2是免疫反映的重要介导分子,也是重要的抗肿瘤细胞因子之一。在体外，IＬ2可促使细胞毒性Ｔ细胞、NK细胞及辅助T细胞增殖、诱导产生细胞毒性的细胞因子,诱导ＬＡＫ细胞增殖。抗体IL2融合蛋白可将ＩL2靶向肿瘤灶,提高肿瘤局部IＬ２的浓度，从而达成更加好的抗肿瘤效应,同时也有助于减轻IL２的毒性。Heｕseｒ等构建了抗黏蛋白的scFvFｃIL2融合蛋白(C595scFvFcIL2）,实验表明此融合蛋白能同时特异性地结合MＵCI+的肿瘤细胞和ＣD25+的免疫效应细胞。体外实验还发现，该融合蛋白能刺激活化的T细胞增殖,介导静息的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。在免疫重建的SCID鼠黑色素瘤肝、肺转移瘤模型中,肿瘤特异性的融合蛋白Ch２２5IL2和Cｈ１4.18IL2可克制转移灶的生长，甚至在注射肿瘤细胞后8d，肿瘤己形成状况下,也能完全消退微转移病灶。该研究表明借助抗体将细胞因子导向到肿瘤部位的免疫治疗办法可有效对抗人类黑色素瘤的播散。Reinaｒtz等将IL6与抗独特型单克隆抗体重组,制备了chＡＣA１25IL6融合蛋白并将其用于卵巢癌的研究。小鼠抗独特型单抗ＡCA125模拟卵巢癌细胞上的CA１２5抗原，可诱导抗－抗独特型抗体反映,该反映与卵巢癌患者生存时间呈正有关。实验成果表明:融合蛋白接种后抗CA12５(Ab3）的浓度较ＩＬ6与ｃhACA联用高,且未观察到抗人IL6抗体的产生,而联用状况下能够检测到抗人IL6抗体产生。IＬ１2是介导先天免疫及细胞免疫的重要细胞因子,含有很强的克制肿瘤及制止肿瘤转移的活性。在体外，ＩL12对于肿瘤细胞没有直接的作用,但IＬ１2能激活T细胞及NK细胞，刺激CＤ4＋T细胞向Th1细胞分化，后者产生的细胞因子可激活ＣTＬ和巨噬细胞。IL1２也是血管形成的强效克制剂,可通过诱导IFNγ等的分泌克制血管形成,进而克制体内肿瘤的生长。纤连蛋白（fibｒonｅcｔin,FN）为一种高分子量多功效糖蛋白，是血管形成的标志，重要聚集于新生血管的周边,在肿瘤的浸润事件中起重要作用。Haliｎ等采用抗ＦＮ的ｓｃFｖL19与IL12融合，发现该融合蛋白含有强大的抗肿瘤活性,可造成肿瘤组织中的T细胞、NK细胞及巨噬细胞浸润。另外，在鼠肿瘤肺转移动物模型中证明,应用该融合蛋白治疗比应用等量的IＬ12含有更强的抗转移效应。GＭCSＦ能刺激造血细胞的增殖及分化,也是一种多功效的免疫调节因子。GMCＳF能提高多个ＡPC的抗原提呈及增进单核细胞体现ＭHCII类分子、粒细胞体现黏附分子及刺激T细胞增殖。动物实验证明,注射GMCSF后,通过增强T细胞免疫,能提高抗肿瘤疫苗的保护效应。Hｅｌguerａ等将鼠GMCＳF与HＥR2抗体融合,观察到该融合蛋白既保持了与人HER2/neu抗原的特异性结合能力,同时也保持了与重组鼠ＧMＣSF相似的生物学活性，在小鼠体内能够明显克制体现ＨEＲ2/ｎeu的肿瘤细胞生长,能同时增强Th1和Ｔh２型细胞的免疫应答。2．５细胞因子与毒素融合蛋白细胞因子与毒素的融合蛋白是以细胞因子取代毒素分子的识别区域,使毒素蛋白能选择性地杀伤含有对应细胞因子受体的靶细胞,从而达成治疗那些细胞因子引发病理性作用的疾病,如本身免疫性疾病、移植排斥反映等。肿瘤细胞因其恶性增殖、缺少接触克制的特性,不同肿瘤细胞都有其异于正常组织细胞的受体特性，将细胞因子与毒素蛋白融合,可运用细胞因子作为靶向载体将细胞毒素运输到肿瘤微环境,使该融合蛋白能选择性杀伤含有对应细胞因子受体的靶细胞，实现靶向肿瘤的治疗作用。白喉毒素含有高效的细胞毒性,运用其与不同的目的基因融合成的多个毒素复合物,可对体现某些特异性受体或蛋白的细胞产生杀伤作用,特别是某些肿瘤细胞。体外实验表明，白喉毒素ＩＬ2的融合蛋白(DAＢ3８9ＩL2)对体现高亲和力IL2受体的细胞株起毒性作用,而缺少完整的高亲和力受体的细胞株(有p55亚单位而无p75亚单位）则对该融合毒素相对耐受。Saleh等报道ＤAB3８９IＬ2在皮肤T细胞淋巴瘤(cuｔａneｏusTcelｌｌｙｍphoma,CTCＬ）Ⅰ期临床实验中单独使用显示出明显的临床治疗效果。ＤAB3８９IL2已成为美国食品与药品管理局(FDA)同意的临床治疗药品。张建新等基于骨髓瘤、原发性肝癌等肿瘤细胞表面ＩL6受体可过分体现的事实，用IL6cDNA取代白喉毒素的受体结合区，构建体现了白喉毒素/ＩL6融合蛋白。研究表明,此种融合蛋白对表面有大量IL6受体的骨髓瘤细胞(U26６）有较强的细胞毒作用而IL6受体较少的正常细胞对其有一定的耐受性。前列腺特异性抗原启动子(pｒｏstatespecｉfｉcantiｇenｐrｏmoｔeｒ,ＰSＰA)含有高度的组织特异性,仅在PＳPA阳性的前列腺癌细胞中体现。Yu等构建了以人免疫缺点病毒为基础的病毒体现载体,在该载体中使ＰSＰＡ和DTＡ(白喉毒素A基因)基因形成融合基因。成果表明,PSPA能够高效、特异地在前列腺癌细胞中启动DTＡ基因体现并产生自杀作用。体外实验表明，它在雄激素存在的状况下能够杀死PSA阳性的前列腺癌细胞。在异种移植PSA阳性的前列腺癌细胞鼠体内实验证明,能够使肿瘤细胞快速退化,并使其存活时间超出一年而没有肿瘤的进展,但在ＰSＡ阴性的对照却没有这种效果。这一研究成果表明转染基因能够对进展的前列腺肿瘤产生治疗效果。假单胞菌外毒素A(pseudomonasｅxotoｘｉnA,PＥ)为不可逆性蛋白合成克制剂,将其细胞结合域删除即为PE40,其仅体现出极低的细胞和动物毒性。将编码TGFα的基因与PＥ4０基因融合，其体现产物现有TGFα受体结合活性又保存有PE的细胞毒性。某些肿瘤如人类胰腺癌组织过分体现上皮生长因子受体（EGFreceptor),其配体之一即TGFα。实验证明TP４０这一双功效蛋白能克制或杀伤体现高水平EGF受体的肿瘤细胞。2.6细胞因子与血清白蛋白融合血清白蛋白是血浆的重要成分,正常状况下不易透过肾小球,体内分布极广并且没有酶学和免疫学活性，是抱负的药品载体。白蛋白融合技术含有下列优点：白蛋白与目的蛋白在细胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接,不需额外的体外解决；白蛋白的体现水平较高，与其融合后能够提高目的蛋白的体现水平;白蛋白是一种稳定的“惰性”蛋白,与其融合后能够提高目的蛋白的稳定性;白蛋白融合蛋白含有较长的药品半衰期。如人血清白蛋白(HAS)本身在血浆中的半衰期长达19d,将小分子蛋白药品与HSA融合可有望提高在血液中的半衰期。现在，多个蛋白与HSＡ融合后在实验动物体内半衰期的延长得到了证明。唱韶红等用毕赤酵母中体现的HSAhIＦNα2b融合蛋白在猕猴体内的半衰期约为普通ＩFNα的２0倍。美国马里兰州人类基因组科学(HGＳ)公司进行了一系列HSA融合蛋白质药品的研究，HSＡ/IＦNα融合蛋白[９]、HSA／IFNβ融合蛋白(albuferｏnβ)［10]、ＨSＡ／rIＬ2融合蛋白（ａｌbulｅukin)[1１]、HSA／ｒGCSF融合蛋白(albｕｇrａnｉn）［１2]、HＳA/ｒＨGH融合蛋白(albuｔropin)[１3]都含有明显的半衰期延长作用。３细胞因子融合蛋白技术在兽医学领域的HYPEＲＬＩNK""发展前景细胞因子的种类繁多且每一种细胞因子的作用又含有多样性,其在机体内环境中的互相作用更为复杂,因而细胞因子融合蛋白的研究几乎涵盖了全部常见的细胞因子。在功效上有关的细胞因子或分子,其融合蛋白的生物学活性若能够高于或等于各个组份简朴相加的效果,即含有其它单体分子无法比拟的高效性，便有构建融合蛋白分子的意义[1４]。另首先,细胞因子融合蛋白在与特定的靶向性分子结合之后,可将有一定毒性的细胞因子选择性的、特异性的浓集于病灶局部,使全身性的不良反映降至最低点,即含有某些单体细胞因子所不含有的特异性,也是融合蛋白的研究方向之一。另外,诸多融合蛋白虽有衍生因子的双重活性,但其活性较野生型低或在实际应用中与衍生因子配伍不明显,解决分子的生物学活性与毒副作用问题是细胞因子融合蛋白发展的实践需求。但是,细胞因子融合蛋白也有其缺点,如在重复使用时由于已产生了中和抗体而克制了其活性的发挥。因此，在构建细胞因子融合蛋白时，必须谨慎选择所融合的细胞因子,并且在设计中尽量减少分子量以减少免疫原性。融合蛋白技术是一种很有发展潜力的生物工程技术，在肿瘤治疗研究中[15]，诸多制品已进入了临床实验，并获得了令人鼓舞的进展。现在,有关动物细胞因子的研究也得到了迅猛发展,某些重组细胞因子已在动物疾病的防止、治疗和诊疗,特别是在发展安全、高效基因工程疫苗等方面显示出广阔的应用前景。相信在不远的将来,人们能够应用细胞因子融合蛋白技术设计和获得高体现、高活性的融合蛋白制剂,从而为动物疾病的防控带来新的但愿。【参考文献】ﻫ

［１]ＧustavｓsｏnM,ＬｅｈtioJ,ＤｅnmanS，etal.StabｌeliｎkeｒpeptidｅsfoｒａcelｌulosebindｉnｇdoｍａｉｎlipaｓｅｆusionproteinexｐrｅsｓedinPiｃhiaＰａstoris[J].ProteinEｎｇ,２001,14(9):711-715.ﻫ[2]ChｉqｕitoJＣ,ＦengJＡ.LIＮＫEＲ:aprograｍtogenerａtelｉnｋerｓequencｅｓforfusｉonproteｉns［J].ProｔeiｎＥng,,13(5）：３09-3１2.ﻫ［３］RyoｉcｈiＡ，HｉｒosｈiU,ＡtsｕsｈiK,etal.Designｏfliｎｋerswhｉcｈeffeｃtivelｙｓepａratedｏmainsofａbiｆunｃｔiｏnalｆusioｎprotｅｉn[J].ProｔeinＥng,200１,１4(BSｕpｐ1):52９-５３2.ﻫﻫ[4]LａｉL,ZeffＲ，GoｌｄｓchｎｅideｒＩ.AｒｅｃoｍｂiｎａntsinglｅｃhaiｎIL7／ＨＧＦbetahybｒｉdcytｏkｉneｉｎducesjｕxtａcrineiｎteractiｏnｓoftheIL７andHGF(ｃＭet)receｐtorsandstｉｍulａｔｅsthepｒolifeｒatｉｏnoｆCFUS1２,CLＰsａndpｒｅpｒoBcｅlls[Ｊ].Blooｄ，200６,107(5):1776-17８4．ﻫ[5]AｎtoｎeｌlａA，RichａrdJY.TheCｙtoｋine,Ｇranuloｃytemacｒophagecoｌｏｎysｔimulａｔingfactoｒ(GMCSF),candｅliverBcｌＸLasanextracｅlｌularｆusｉｏnproteintｏｐroｔeｃｔcellｓfromaｐoptoｓisandｒｅtaindifｆeｒentｉａtｉonｉｎductiｏn[J].JＢiolChｅm,,282（1５):112４6-1１2５4.ﻫ[6]杨登科,靳凤烁,张勇,等.Ａg85B/ＩＬ2融合蛋白在体外对PBMC增殖及Ｔh1型细胞因子分泌的影响[J］.医学临床研究,２006，２３(2):181-1８7.ﻫ[7]HitokiY,TｅriH,XingｈoｎgYang,etaｌ.AＮasaｌInｔerleukｉn12DNAＶaｃcineCoｅxpｒｅssingYeｒsiｎiapeｓｔiｓF１ＶFusionProｔeｉnCｏnferｓPrｏtectionａgａinｓtPneumonｉｃPlague[Ｊ].InｆｅｃＩmmｕ,2０08，p456４-４573.[8]MarkDＭ,DerekJA.AfｕsioｎproteiｎconsisｔingofIL16andtheeｎcｅｐhaｌｉｔogenicpeｐtideｏｆmyelｉnbａsicproｔeinｃｏnｓtiｔutesａｎａntigｅｎsｐeｃiｆicｔolerogenicvaccｉnethａtinhiｂitsｅxperimｅｎtaｌａutoimmｕnｅｅncｅphaloｍyｅlitｉs[J].JImmunol,,17９:14５8-1465.［9］OsbornBL，OｌsenＨS,ＮardelliB,etaｌ.Pharmacokinｅticaｎｄpharmacｏｄynamiｃstｕdｉeｓoｆahuｍaｎｓｅrumaｌｂｕminｉｎｔerfｅronalｐhafusiｏｎpｒｏtｅininｃｙnomｏｌgusmoｎkeｙs[J].PharmacolExpＴhｅｒ,,３０３(2):５4０-548．［10]SungC,NaｒｄellｉB,LａＦleurDW,etal．ＡｎIFNbetaａlｂumiｎfu