神经生物学研究常用方法

神经生物学研究的惯用办法神经科学的发展与的研究办法的进步亲密有关。总体上，神经生物学的研究办法有六大类：形态学办法、生理学办法、电生理学办法、生物化学办法、分子生物学办法及脑成像技术。形态学办法神经生物学研究中惯用的形态学办法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其它尚有受体定位、神经系统功效活动形态定位等办法。束路追踪法追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目的，它对研究神经元的功效、神经系统的发育和成熟都含有重要意义。这种办法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变（顺行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变）研究。20世纪40年代重要手段是镀银染色法，根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。20世纪50年代发展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过氧化物酶（HRP）注入幼鼠的腓肠肌及舌肌成果在脊髓和延脑的对应部分运动神经元胞体内发现HRP的积累。很快LaVail正式使用HRP作为轴突逆行追踪，后来遂广泛应用于中枢神经系统的研究。HRP可被神经末梢、胞体和树突吸取，轴突损伤部分也可摄入。在胞体内，HRP的活性可持续4~5天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反映而显现出来。被标记的神经元能够清晰的显示胞体、树突及轴突。除了HRP标记法，尚有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等办法。免疫组织化学免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。这种办法特异性强，敏感度高，进展快速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不停提高，免疫组织化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研究，并获得重大突破，并且也用于疾病的早期快速诊疗等临床实际。组织的多肽和蛋白质种类繁多，含有抗原性。分离纯化人或动物组织某种蛋白质，作为抗原注入另一种动物体内，后者即产生对应的特异性抗体（免疫球蛋白）。从被免疫动物的血清中提取出该抗体，再以荧光素、酶、铁蛋白或胶体金标记，用这种标记抗体解决组织切片或细胞，标记抗体即与细胞的对应蛋白质（抗原）发生特异性结合。惯用的荧光素是异硫氰酸荧光素（FITC）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC），在荧光显微镜下可观察荧光抗体抗原复合物。惯用的酶是辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP,从辣根菜中提取的），它的底物是3，3'－二氨基、联苯胺（DAB）和H2O2,HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观察。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原的结合，也可在光镜和电镜下观察。标记抗体被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的抗原直接结合。这种办法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体（第一抗体简称一抗）再作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体（抗原）的抗体（第二抗体简称二抗），再以标记物标记二抗。先后以一抗和标记二抗解决样品，最后形成抗原一抗－标记二抗复合物。间接法中的一种抗原分子可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它的敏感度较高，并且现在国内外都有多个标记二抗商品供应，使用方便。间接法中较惯用的是一种称之为过氧化物酶－抗过氧化物酶复合物法（peroxidase-antiperoxidasecomplexmethod,PAS法），该法除需一抗和二抗外，还需制备HRP标记的抗酶抗体，即以HRP作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP标记该抗体制成由3个酶分子与2个抗酶抗体构成的相称稳定的环形PAP复合物。标本先后以一抗、二抗和PAP复合物解决后，再以DAB显色，即可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大而与多个酶分子结合，因此敏感性很强。免疫组织化学术近来又有新进展，如生物素－亲合素等新颖试剂的应用，为检测微量抗原、受体、抗体开辟了新途径。生物素（biotin）又称维生素H，是从卵黄和肝中提取的一种小分子物质（分子量244.31）；亲合素（avidin）又称卵白素，是从卵白中提取的一种糖蛋白（分子量68kD）。每个亲合素分子有生物素结合的4个位点，两者可牢固结合成不可逆的复合物。生物素－亲合素的应用大致有三种办法。①标记亲合素－生物素法（labelledavidin-biotinmethod,LAB法）：将亲合素与标记物（HRP）结合，一种亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一种抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。②桥连亲合素－生物素法（bridgedavidin-biotinmethod,BAB法）：先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达成多层放大效果。③亲合素－生物素－过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod,ABC法）；此法是前两种办法的改善，即先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素－生物素－过氧化物酶复合物（ABC复合物），标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，最后形成晶格样构造的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的敏捷度。现有配制现成的ABC药盒商品供应，操作简便，是现在广泛应用的一种办法。原位杂交法（insituhybridization）原位杂交术是一种核酸分子杂交技术，它是通过检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因体现。其基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配对的特点，应用已知碱基序列并含有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞内的待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类重要有三种：①运用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA);②应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反义RNA探针(cDNA);③根据待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。cRNA和cDNA的惯用标记物有32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。组织学应用的原位杂交术重要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与体现；后者是研究细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定位与体现。核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫细胞化学的基础上，进一步从分子水平探讨细胞功效的体现及其调节机制的，已成为现在神经生物学研究的重要手段。生理学办法神经生物学研究中的生理学办法有行为学办法、神经递质释放量的测定等，其中行为学办法最为惯用。行为学办法行为学办法是建立在条件反射基础之上。条件反射是出名的俄国生理学家巴甫洛夫于20世纪初提出的。条件反射是动物个体生活过程中适应环境的变化，在非条件反射基础上逐步形成的。形成条件反射的基本条件就是无关刺激与非条件刺激在时间上的结合，这个过程称为强化。要形成条件反射除需要多次强化外，还需要神经系统的正常活动。巴甫洛夫及其学派所研究的条件反射，称为典型性条件反射。另一种条件反射叫操作性(工具性)条件反射，美国心理学家斯金纳(B．F．skinner)把一只饿鼠放入实验箱内，当它偶然踩在杠杆上时，即喂食以强化这一动作，经多次重复，鼠即会自动踩杠杆而得食。在此基础上还能够进一步训练动物只对某一种待定信号，如灯光、铃声出现后，做出踩杠杆的动作，才给以食物强化，这类必须通过自己某种活动(操作)才干得到强化所形成的条件反射，称为操作性条件反射或工具性条件反射。操作性条件反射和典型性条件反射的基本原理是相似的，它们都以强化和神经系统的正常活动为基本条件，但它们之间也有不同之处。在形成操作性条件反射过程中，动物能够自由地活动，它通过主动操作来达成一定的目的；但在形成典型性条件反射时，动物往往被束缚着，是被动地接受刺激。另外，在操作性条件反射中强化只同反映(操作)有关，并出现在反映之后；而在典型性条件反射中，强化是同刺激有关，并且出现在反映之前。电生理学的办法电生理学的办法涉及胞外统计、胞内统计、脑内电刺激、电压钳、膜片钳、脑电图等技术。电生理学发源于1791年。电流计的发明和应用于电生理学，初步满足了统计生物电活动的变化量小而变化速度快的特点。19Erlanger和Gasser用了电子管放大器和阴极射线示线器，才彻底满足了统计生物电活动的基本特点。从此神经生理学得以迅猛发展。20世纪40年代以来，英国剑桥大学Hodgkin学派运用微电极技术，并且选用了抱负的实验标本枪乌贼的巨轴突，在修正了Bernstein膜学说的基础上，建立了动作电位的钠学说，阐明了神经冲动的传导理论。约在同一时期，Forbes和Renshaw等运用微电极开始了研究中枢神经系统神经元活动的工作。Hodgkin等人为精确测量神经活动中的离子运动，发展了电压钳实验技术。电压钳把单一的跨膜离子流从众多的离子流中分离出来，通过离子流的测定来分析离子通道开放及关闭的动力学变化。双微电极电压钳技术是把两根尖端不大于0.5μm的玻璃电极插入细胞内分别作为电位统计电极和电流注入电极。电位统计电极引出的膜电位经电压钳仪的前置放大器放大后，输入至电压钳仪的运算放大器的负输入端，而人为控制的指令电位输入其整输入端，两者的不停进行比较，将差值送入驱动放大电路，两者的任何差别都会被放大电路放大，并通过电流注入电极将相反方向的电流注入细胞，是膜电位钳制在指令电位水平。此时，注入细胞的电流值与标本兴奋时的跨膜电流值大小相等，方向相反。在此基础上,Neher又发展了膜片钳技术。它是将尖端直径仅为1μm的玻璃电极吸附到细胞膜表面上，对微电极内施加负压，微电极与细胞膜形成10GΩ的高阻封接，可统计膜上的pA级的离子通道电流，为从分子水平理解生物膜离子单通道的开、关动力学，通透性和选择性提供了直接手段。为此Neher获得1991年诺贝尔医学或生理学奖。在电生理技术中脑电图和诱发电位的描记反映了脑细胞群体活动的总和性电位，在临床诊疗方面含有重要价值。神经系统的电生理办法，对神经科学的理论发展起着重要作用。生物化学的办法典型的生物化学办法涉及离心、电泳、层析、质谱等。由于生物化学办法与药理学、免疫学等其它学科相结合，又发展了放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)、放射受体和免疫印迹等方面。离心法是多个制备、鉴定办法的起始环节，几乎没有一种实验没有离心法，也几乎没有一种实验仅用离心法就能完毕。多个层析法是用来制备、鉴定和分离物质的重要手段，普通需将几个不同的层析法交替使用，才干达成预期的成果。由于HPLC和FPLC的使用，使分离的效率和分辨率大大提高。RIA是用来检测生物体内低含量物质（如神经介质、激素）的重要手段，也是对抗体进行检查的重要手段。RIA重要用来分析研究受体的特性，也可用于测定某一受体的配体的含量及分析比较多个配体的作用强度。免疫印迹法结合了电泳及KIA的优点，是鉴定蛋白质及肽类分子的抱负办法。分子生物学的办法分子生物学技术同神经生物学结合产生了分子神经生物学，分子生物学技术在神经生物学中的应用有基因的分子克隆及体现、聚合酶链反映（PolymeraseChainReaction，PCR）、遗传连锁分析、反向遗传学等。PCRPCR是运用耐高温的DNA聚合酶体外快速扩增DNA的技术。通过PCR能够简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核酸，并含有很高的敏捷度和特异性，可用于微量核酸样品的检测。PCR技术原理是将欲扩增的DNA做模板，以和模板正链和负链互补的两种寡聚核苷酸做引物，通过模板DNA的变性、模板与引物结合复性及在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反映的三步循环来扩增两引物间的DNA片段。每一循环的DNA产物经变性后又成为下一种循环的模板DNA。这样，目的DNA的数量将以2n指数形式累积，短时间内的30个循环，DNA量就可达成原来的上百万倍。神经与精神性遗传疾病的基因定位、分离克隆与突变检测基因定位是基于基因的连锁分析和关联分析。在家系中，位于同一染色体上的两个位点（致病基因和遗传坐标）在减数分裂的过程中会发生交换和重组。重组率越高，两个位点在一起传给后裔的机会就越少，反之，越高。通过用覆盖密度适宜的遗传图中的遗传坐标在家系中进行连锁分析，以此找到与某以作标紧密连锁的致病基因，从而拟定该基因在染色体上的粗略位置。惯用的遗传坐标有RFLP、小卫星坐标、微卫星坐标及单核苷酸多态坐标等。关联分析是在可能的候选致病基因附近选择遗传坐标等位片段多态性，在正常人和病人之间进行比较，得到某一坐标等位片段和引发疾病基因关联的相对危险度。基因的分离与克隆的基本原理是在克隆有人基因组的YAC（或BAC或cosmid等文库中找到对应于基因定位的染色体区域，通过STS是载有该区域片段的文库按对的方向排列成重叠群。寻找到存在这些片段上的基因，再用适宜的限制性内切酶进行切割分离，并克隆到按设计规定的载体上。影像技术在神经生物学研究中的应用计算机断层扫描术（CT）CT技术的核心是X光源，X光检测器和计算机系统。位于头颅一侧的X光源发出一束平行的X光束，X光束透过头颅后由位于头颅另一侧的X光检测器接受。X光源和X光检测器可围绕头颅作180度旋转，在每个旋转角度上都能够得到一组放射密度测量数据。计算机把成千上万的不同位点的放射密度换算成对应的衰减系数，然后根据每一种位点的衰减系数大小用不同的黑白亮度来显示。CT可清晰地显示颅骨、脑组织和脑脊液，但不能用于检测大脑的功效。编辑本段CT扫描仪的发展历程自从X射线发现后，医学上就开始用它来探测人体疾病。但是，由于人体内有些器官对X线的吸取差别极小，因此X射线对那些前后重叠的组织的病变就难以发现。于是，美国与英国的科学家开始了寻找一种新的东西来弥补用X线技术检查人体病变的局限性。1963年，美国物理学家科马克发现人体不同的组织对X线的透过率有所不同，在研究中还得出了某些有关的计算公式，这些公式为后来CT的应用奠定了理论基础。1967年，英国电子工程师亨斯费尔德在并不懂得科马克研究成果的状况下，也开始了研制一种新技术的工作。他首先研究了模式的识别，然后制作了一台能加强X射线放射源的简朴的扫描装置，即后来的CT，用于对人的头部进行实验性扫描测量。后来，他又用这种装置去测量全身，获得了同样的效果。1971年9月，亨斯费尔德又与一位神经放射学家合作，在伦敦郊外一家医院安装了他设计制造的这种装置，开始了头部检查。10月4日，医院用它检查了第一种病人。患者在完全苏醒的状况下朝天仰卧，X线管装在患者的上方，绕检查部位转动，同时在患者下方装一计数器，使人体各部位对X线吸取的多少反映在计数器上，再通过电子计算机的解决，使人体各部位的图像从荧屏上显示出来。这次实验非常成功。1972年4月，亨斯费尔德在英国放射年会上初次公布了这一成果，正式宣布了CT的诞生。这一消息引发科技界的极大震动，CT的研制成功被誉为自伦琴发现X射线后来，放射诊疗学上最重要的成就。因此，亨斯费尔德和科马克共同获取1979年诺贝尔生理学和医学奖。而今，CT已广泛运用于医疗诊疗上。编辑本段CT扫描仪的工作程序CT的工作程序是这样的：它根据人体不同组织对X线的吸取与透过率的不同，应用敏捷度极高的仪器对人体进行测量，然后将测量所获取的数据输入电子计算机，电子计算机对数据进行解决后，就可摄下人体被检查部位的断面或立体的图像，发现体内任何部位的细小病变。正电子发射计算机断层扫描（PositronEmissionTomography，ＰＥＴ）正电子发射计算机断层扫描（PositronEmissionTomography，ＰＥＴ）是核医学发展的一项新技术，代表了当代最先进的无创伤性高品质影像诊疗的新技术，是高水平核医学诊疗的标志，也是当代医学必不可少的高技术。ＰＥＴ的独特作用是以代谢显像和定量分析为基础，应用构成人体重要元素的短命核素如11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、18Ｆ等正电子核素为示踪剂，不仅可快速获得多层面断层影象、三维定量成果以及三维全身扫描，并且还能够从分子水平动态观察到代谢物或药品在人体内的生理生化变化，用以研究人体生理、生化、化学递质、受体乃至基因变化。ＰＥＴ能够说是同位素发射计算机辅助断层（ＥＣＴ）的一种。正电子发射是放射性元素衰变的方式之一。这类核素在自发地从不稳定状态向基态衰变过程中，从核内释放出与普通电子同样但电荷相反的粒子，即正电子。正电子是一种反物质，从核内放出后很快于环境中自由电子碰撞湮灭，转化为一对方向相反、能量为511kev的γ光子。如果在这对光子飞行方向上对置一对探测器，便能够几乎在同时接受到这两个光子，并可推定光子发源（即正电子发射）点在两控头间连线上。通过围绕360°排列的多组配对探头，经探头对间符合线路检查鉴定每只探头信号时间耦合性，排除其它来源射线的干扰，得到探头对连线上的一维信息，再用滤波反投射方式，将信号按探头对的空间位置向中心点反投射，便可形成与探头组连线轴平行的断层面正电子发射示踪剂分布图像。这种探测方式一次只反映一种层面的信息，与CT探测方式很靠近，实用中惯用多层排列的探头对，配合层间符合线路，以利探测并重建更多层面的图像。在临床中，当由正电子放射性核素所标记的示踪剂（显像剂）注入血流后，达成全身，聚集在特定的器官或某一部位，通过对应的探头，采用符合线路技术，探测器从360°方向检测不同部位的光子，统计释放出光子的时间、位置数量及方向。显像装置绕人体旋转，多角度采集，信息经计算机贮存，再通过影像重建原理获得人体各部位横断、冠状断面和矢状断面影像。ＰＥＴ显像仪的构造与Ｘ线、ＣＴ或ＳＰＥＣＴ基本相似，由探头、数据解决系统、图像显示及检查床构成。大多数PET使用放射性2-18氟-2-D-脱氧葡萄糖（ＦＤＧ）作为示踪剂，这种类型的葡萄糖与普通葡萄糖化学性质相似，可在人体中产生有标记的代谢物，并且在人体中存留时间较长，便于测量。正常脑组织、心肌组织、肾脏及膀胱组织由于高糖代谢的需要因而对ＦＤＧ摄取较多。其它某些组织如肝脏、肌肉和肠壁由于其糖代谢水平低，则对ＦＤＧ的摄取量较少，显示出的ＦＤＧ活性水平也较低。其它用于PET研究的示踪剂如[15O]H2O可用来测量局部脑组织、心脏或肾脏的血流量，18F-DOPA、18F-UDR可用于评价受体的部位、密度及活动水平等。FDGPET中病人所接受的放射线剂量与CT基本相似。正常范畴PETPET特别合用于在没有形态学变化之前，早期诊疗疾病，发现亚临床病变以及评价治疗效果。现在，PET在肿瘤、冠心病和脑部疾病这三大类疾病的诊疗中特别显示出重要的价值。检查介绍PET中文译名为“派特”，是一种非创伤性的用于探测体内放射性核分布的影像技术。其全称中的“正电子”临床意义传统的医学影像技术显示的是疾病引发的解剖和构造变化，而PET显示的则是人体的功效变化。换言之，如果人体的解剖构造没有发生变化，传统的影像技术对于疾病的诊疗是无能为力的。事实上，疾病的发生都随着着生化过程的功效变化，这些变化往往要早于解剖构造的变化；尚有某些疾病如早老性痴呆、帕金森氏病等本身就没有明显的构造变化，传统的医学影像就无法显示这些功效方面的变化了。PET能得天独厚地显示功效性的变化，因而对疾病的更早期发现、诊疗含有优势；另外，PET还能进行三维立体动态及全身显像，可发现其它检查所不能发现的问题，避免了“—叶障目，不见泰山”，弥补了传统医学影像的局限性。基本原理PET是运用发射正电子的同位素作为标记物，将其引入脑内某一局部地区参加已知的生化代谢过程，运用当代化计算机断层扫描技术将标记物所参加的特定代谢过程的代谢率以立体成像的形式体现出来，可测定到组织对葡萄糖的运用和脑的局部血流量（敏捷度高达皮摩尔）。磁共振成像（Magneticrexonanceimaging,MRI）磁共振成像从原理的发现到现在临床多个先进成像技术的应用，是基于科学家们对原子构造的不停认识。1924年Pauli发现电子除对原子核绕行外，还可高速自旋，有角动量和磁矩。1946年美国哈佛大学的Percell及斯坦福大学的Bloch分别独立地发现磁共振现象并接受到核子自旋的电信号，同时将该原理最早用于生物实验，在物理学、化学方面作出了较大的奉献。1952年荣获诺贝尔物理奖。磁共振成像的构想出自Damadian。1971年发现了组织的良、恶性细胞的MR信号有所不同。1972年P.C.Lauterbur用共轭摄影法产生一幅试管的MR图象。1974年作出第一幅动物的肝脏图象。核子的自旋和磁矩的存在，使其能够在强大的磁场中旋进。Radi测出不同核子的角动量和磁矩。不同核子在同一磁场中其磁矩和角动量各不相似。同一核子在不同场强的磁场中，其振荡频率也不相似。磁共振是共振现象的一种，是指原子核在进动中吸取外界能量产生的一种能量跃迁现象。这种跃迁只能出现在相邻两个能量级之间。所谓外界能量是指一种激励电磁场（射频磁场），它的磁矢量在某一种平面上旋转，因此，除其旋转频率正好与原子核回转频率相似外，其自旋方向必须和核磁矩相似，原子核才会吸取到能量，这是磁共振现象的必要条件。磁共振成像技术的发展产生了许多成像技术办法，但总的设计思想是如何用磁场值来标记受检体中共振核子的空间位置。发生共振的频率与它所在的位置的磁场强度成正比。如果能使空间各点的磁场值互不相似，各处的共振频率也就不同，把共振吸取强度的频率分布显示出来，实际就是共振核子的分布，即核磁共振自旋密度图象。但不可能使同一时刻的三维空间中各点含有不同的磁场值，因此需设计突出各特定点信息的方案。要达成此目的，首先可对观察的对象进行空间编码，把研究对象简化为由nx，ny，nz个小体积（体素）的构成，然后采用依次测量每个体素或由体素排列的线或面的信息量，再根据个体素的编码与空间位置的一一对应关系实现图象重建。由于成像的敏捷度、分辨率、成像时间和信噪比（S/N）等规定不同，产生了多个成像办法，归纳起来可分为两大类：一是投影重建法；二是非投影重建法，涉及线扫描成像法和直接傅立叶变换（fouriertransform）成像法。StepofstereotaxicsurgeryThestereotaxicinstrumentisfixed.Toachievetheflatskullposition,theincisorbarwasadjustedaboveinterauralzero.（accordingtotheinstructionofbrainmaps）.Micewereanesthetizedwithsodiumpentobarbital(40mg/kgbodyweight,i.p.)forstereotaxicsurgery.Comparedtoarat,theskullofamouseispaperthin.Theairwaysrunthroughthecenterlinedirectlybetweenthetwoears.Thus,itisveryeasytostrangleamousewithevenlightlyappliedearbars.Ifearbarsareusedonamouse,thesurgeonmustbeverywatchfultoseethattheyareinfirmlyenoughtoholdtheheadstable,andthattheanimalcontinuestobeabletobreaththroughtheentireprocedure.Toavoidthis,mostresearchersworkingonmiceuseanoseonlyholder,andnotearbars.This,however,introducesseriousinstability,particularlyifthesurgeryisbacktowardthebrainstem,astheleveragetomoveincreasesthefurtherbacktheworkisbeingdone.Instabilitymeansreducedaccuracy,andmoreanimalsneeded.AnalternativeistheCunninghamheadholderformice(orneonatalrats,whereasimilarsituationapplies)thatemployslight,smallplasticearbarsthatallowthesurgeontofeelthepressureofapplicationbetterthanwiththeheavystainlesssteelearbarscommonlyused.Theseallowearbarstobeusedsuccessfullyonadultmice.Stainless-steelguidecannulasareimplantedintonucleusaccordingtobrainmaps.Guidecannulaswerefixedtotheskul