DB6528T189-2023加工辣椒品种InDel指纹数据库构建规范

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6528巴音郭楞蒙古自治州地方标准DB6528/T189—2023加工辣椒品种InDel指纹数据库构建规范ProcessingpeppervarietiesInDelfingerprintdatabaseconstructionspecification.20232023080120230815巴音郭楞蒙古自治州市场监督管理局  发布DB6528/T189DB6528/T189—2023DB6528/T189DB6528/T189—2023目 次前言 II范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1InDel标记鉴定程序 2标记类型及标记来源 2检测方法 2质量保证 2DNA质量 2引物序列 2酶及PCR反应相关试剂 3PCR扩增反应 3样品的来源及性质 3品种来源 3样品类型 3样品分析数量 3引物及流程的评估 3评估用的品种数量及名单的确定 3引物评估的取舍 4不同来源数据的有效整合 4固定一套核心引物 4提供标准品的要求 4提供标准DNA的要求 4确定引物等位基因BIN的要求 4异常带型的数据处理方式 4数据的编码方式 4构建品种DNA指纹模式库 5构建品种DNA指纹扩展库 5数据库数据的随机盲测 5I前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由新疆巴音郭楞蒙古自治州农业农村局提出并归口。本文件主要起草人：张建文、张国儒、杨生保、唐亚萍、杨涛、李辉玲、帕提古丽·艾斯穆托拉、火顺利、董洁、叶远荣。本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院。（新疆库尔勒市石化大道64号小区（新疆库尔勒市英下路巴州农科院新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院联系电话邮编：841000新疆维吾尔自治区农业科学研究院园艺所联系电话邮编：830091新疆巴音郭楞蒙古自治州市场监督管理局联系电话邮编：841000IIII加工辣椒品种InDel指纹数据库构建规范范围本文件规定了加工辣椒品种InDelDNADNA本文件适用于加工辣椒品种鉴定及DNA指纹库的建立。规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。术语和定义下列术语和定义适用于本文件。InDel标记Insertion-deletion根据基因组中插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR引物，这就InDel标记。DNA指纹DNAfingerprint具有完全个体特异的DNADNAPAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。注：根据寡核苷酸的大小来分离，因此可将全长产物与不完整的短分子分开，适合变性蛋白的处理。引物primer是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3’-0H上，核苷酸以一酯链形式进行合成，因此引物的3’-0H，必须是游离的。核心引物coreprimers指多态性、稳定性、重复性等综合特性好、可作为DNA指纹鉴定优先选用的一套引物。注：定性状进行调整。标准品种standardvariety1DNA指纹库构建过程中作为谱带分型的参照标准，并辅助判断试验的稳定性和可靠性。注：以一套典型的遗传基础广泛的高度纯合自交系为试材，对拟建库的引物进行DNA指纹分析，就可确定代表每个引物不同谱带的标准品种名单。DNAstandardDNA由一个实验室统一按规定的DNA提取方法一次性提取足量的标准品种的DNA，经DNA指纹分析验证其真实的指纹带型后统一发放。InDel通过设计特异性引物并进行PCR（或聚丙烯酰胺凝胶电泳）和放射自显影（或银染），可检测到在简单重复序列重复单位数不同的DNA区域的多态性。标记类型及标记来源采用InDel标记作为加工辣椒DNA指纹库构建的标记方法。检测方法7质量保证DNA质量纯度要求:OD260/OD280在1.8～2.0之间。7质量保证DNA质量纯度要求:OD260/OD280在1.8～2.0之间。引物序列表1 17对引物序列表2引物编号标记名称上游引物下游引物InDel16CIDH119AGGAACTAAAAAGTGGTTTTGGGTTCACACACGTCCAACCCAATInDel33CIDH108ACAATCGAAGGGGAGCCTTGTCCTCTGTTTCATGATTCCGACTInDel41CIDH116AGGAGAAAAAGAAAGAACAACCACACGAAGCCCTTCACATTAACGTInDel63CIDH110ACTCTTGGAAGATGGGGTTCACCGAAGTAAAATAGGAAAATTGCCAInDel88CIDH107AGCCCAATAGAAAGATTGCTCACGCTGAATTTTGAAATATTTAGTCTGGInDel137CIDH128ACAAGGAGAAAAGGGGCCTTCTGTATCTCGGCTTAAAGGGGTInDel146CIDH109GGAACCCGACCACCAGAAAATCGCGGGGACTATTTACCCTInde1172CIDH135GGTGGGACCAAAGAGAGTTTTGAACAAGCAAAAGCCAAGA表117对引物序列表（续）引物编号标记名称上游引物下游引物InDel200CIDH135ACTCACAGTCCTTAAACTTACAAAACTTGCCACTATAAATCCATCACCGAInDel201CIDH136AGGCACCAGTTAGCTCGAAAAGCGCATCTCAATCTATGTCGAInDel206CIDH113CCTGGAGGCTATGCACCATTATTTGCAGCCACCCAGCATAInDel209CIDH116CGCTACGAGTGGTACCTGACTGGGGATTGCTTCATTGGTGTInDel211CIDH118TCAGTTGTGTCCTGAACCCTACATGCAGAACAAATAGCCCTInDel215CIDH122ACCGTTGACACTTCCATGCTAATCCCCACGTGCAGTTCATInDel219CIDH126CCGAGCATTGAGACCGAGTTAAGCTTTCTGATCCACCCCCInDel228CIDH135TGACACGTGACATTCAGCGTTGACCTACAAACACACTGCTCAInDel234CIDH113AAAAAGGGCAGCTCGGTGTAGAACCCCCTGAAGAGAAGGCPCR对构建标准DNA指纹库时采用的试剂指定供货厂家及规格。PCR统一采用相同的反应程序及反应体系。8样品的来源及性质8样品的来源及性质品种来源品种来源应可靠，建库品种主要来自：——新疆维吾尔自治区区域试验和品种审定委员会审定的品种以及品种权保护部门保护的品种；——国家种质资源库；——向育种单位直接征集。样品类型主要包括种子或叶片。可以提供叶片等营养组织或提供符合要求的DNA样品。样品分析数量9引物及流程的评估评估用的品种数量及名单的确定31～2套遗传上或形态上极为相似的材料以评估引物对近似品种的区分能力。引物评估的取舍10不同来源数据的有效整合不同来源DNA指纹数据的有效整合问题是DNA固定一套核心引物17对引物作为构建加工辣椒DNA指纹数据库用的基本核心引物。提供标准品的要求标准品的要求如下：——除了少数稀有谱带类型不易找到标准品种时选用特殊自交系外，宜尽量选用国内外已知的常用自交系为标准品种；——标准品种应纯合；——标准品种应容易扩繁保种；——标准品种由指定的单位统一扩繁保种，统一发放；——宜尽量用较少的品种代表较多种谱带类型。提供标准提供标准DNA的要求提供标准DNA的要求如下：——DNA质量符合要求，纯度高，OD260/OD280在1.8～2.0之间；——DNA经过指纹分析反复验证，证明能够稳定扩增出预期大小的谱带；——同一批次提取的DNA量要大，大于或等50ug。确定引物等位基因BIN的要求确定引物等位基因BIN的要求如下：——应包括主要的等位基因；——如果稀有等位基因也包括在内的话，应标注其为突变型；——每个等位基因根据其表现特征，确定其扩增片段大小的区间范围。异常带型的数据处理方式异常带型主要包括：稀有带型、零带型、弱带型、缺失带型等。——对稀有带型应如实记录，但应标注其为稀有带型；——对零带型应尽量避免，如果某引物出现的零带型比率较高（＞5%），则该引物应剔除；——对弱带型及缺失带型应尽可能通过重新扩增将数据补齐。数据的编码方式主要有3种：4——根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，确定不同的谱带类型，并按扩增片段从大到小的顺序编号。适用于仪器不具有直接读取片段大小的功能的情况；——根据扩增产物的片段大小，直接记录不同谱带片段大小。适用于仪器具有直接读取片段大小的功能且同一多态性位点上采用的引物固定的情况；——将同一多态性位点设计的不同引物获取的数据进行整合。适用于在同一多态性位点同时设计并使用了多个不同引物进行数据库构建的情况。数据整合采取如下两种方案：采用记录扩增片段绝对大小的方式。指定某个引物为该多态性位点的标准引物，该位点设计的其它引物获得的数据按照片段大小整体向上或向下位移的规律，统一转换成标准引物的数据。有引物的数据均以实际片段大小减去该引物扩增的最小片段大小后记录，因此，同一引物位点无论采用多少不同的引物，所获得指纹的编码方式是不变的，但应提供该